Phương pháp Sắc ký là một quá trình tách chất phân tích ra khỏi hỗn hợp bằng cách sử dụng:

  • Pha tĩnh: Chất phân tích được phân chia và được giữ lại
  • Pha động: Phân chia các chất phân tích khỏi pha tĩnh và vận chuyển chúng qua lớp pha tĩnh

Các chất phân tích sẽ có ái lực hóa học khác nhau. Đối với từng pha, những chất có ái lực ít hơn với pha tĩnh sẽ rửa giải sớm hơn. Và những chất có ái lực lớn hơn sẽ rửa giải muộn hơn, do đó sẽ đạt được sự phân tách. Các hóa chất được sử dụng cho pha động và tỷ lệ sử dụng chúng có thể được điều chỉnh để thay đổi ái lực tương đối của chất phân tích. Dẫn đến thay đổi thời gian lưu và độ chọn lọc (khả năng tách hóa học) của quá trình phân tách.

Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đến quá trình phân tách HPLC và độ tinh khiết của dung môi cho các chế độ lưu khác nhau.

Dung môi và rửa giải

Để dự đoán thứ tự rửa giải của chất phân tích, chúng ta cần biết loại cột sắc ký mà chúng ta đang sử dụng và độ phân cực của dung môi pha động so với loại chất phân tích.

Thông thường, để đạt được sự phân tách mong muốn/ cần thiết. Phải sử dụng hỗn hợp các dung môi pha động và quy tắc đầu tiên là các dung môi này PHẢI có thể trộn được. Biểu đồ khả năng trộn lẫn của hóa chất có thể được sử dụng để xác định xem hai dung môi có thể trộn được với nhau hay không.

Cach chon dung moi phan tich
Biểu đồ khả năng trộn lẫn của dung môi.

Dung môi phân cực  và tính chất hóa học

Có nhiều yếu tố kiểm soát  khả năng phân tách của hệ thống sắc ký. Bao gồm bản chất của dung môi pha động, độ pH của pha động. Cũng như tính chất và cường độ ion của bất kỳ chất đệm nào được sử dụng. Ví dụ, trong HPLC pha đảo, người dùng thường chọn Acetonitril hoặc Metanol (hoặc hỗn hợp của cả hai). Với nước làm thành phần pha động chính khác.

Metanol và acetonitril có các tính chất cơ bản khác nhau về mômen lưỡng cực, độ axit và tính bazơ. Do đó sẽ tạo ra sự phân tách có khả năng phân tách khác nhau. Bằng cách trộn các tỷ lệ khác nhau của các hóa chất này. Hoặc bằng cách sử dụng các cấu hình gradient khác nhau. Độ chọn lọc của quá trình phân tách có thể được ‘điều chỉnh’ để tạo ra độ phân giải tốt nhất giữa các chất phân tích.

Trong HPLC pha đảo, lượng dung môi hữu cơ so với thành phần nước thường thấp hoặc bắt đầu ở mức thấp. Sau đó tăng lên trong quá trình tách gradient. Trong sắc ký tương tác ưa nước (HILIC) thì sẽ ngược. Trong sắc ký pha thông thường, hai dung môi hữu cơ được sử dụng. Một hóa chất có ái lực hóa học cao hơn với pha tĩnh so với hóa chất kia. Do đó được sử dụng để thay thế các chất phân tích và hoạt động giống như chất biến tính hữu cơ trong sắc ký pha đảo.

Chọn đúng dung môi và thu được tỷ lệ dung môi chính xác là kỹ năng quan trọng trong việc phát triển phương pháp HPLC. Yếu tố quan trọng tiếp theo cần xem xét là dung môi sẽ được bơm như thế nào. Và có thể được trộn trong hệ thống như thế nào.

Bơm nhị phân và bơm bậc bốn đều có ưu điểm và nhược điểm. Nhưng được yêu cầu trộn chính xác các dung môi pha động khác nhau theo cách có thể tái sản xuất. Trộn trực tiếp các dung môi theo tỷ lệ không đổi (cố định) trong toàn bộ quá trình phân tích được gọi là chế độ tách Isocratic. Khi một dung môi được tăng tỷ lệ với dung môi khác trong một khoảng thời gian xác định trước.

Máy bơm nhị phân sử dụng 2 đầu bơm riêng biệt (thực tế là hai máy bơm riêng biệt và độc lập). Và một buồng trộn để cung cấp lưu lượng thể tích dừng nhanh, hiệu quả và thấp trong hệ thống của bạn. Nhưng chỉ có thể cung cấp 2 dung môi cùng một lúc và chúng cũng đắt hơn.

Máy bơm bậc bốn linh hoạt hơn vì chúng có thể vận hành tới 4 dung môi. Theo các tỷ lệ khác nhau trong một gradient nhưng chỉ sử dụng một máy bơm và van định lượng để đạt được điều này. Kết quả có thể là tỷ lệ hỗn hợp kém chính xác hơn một chút so với hệ thống nhị phân.

Một vấn đề nữa cần xem xét trong sắc ký là khả năng các khí hòa tan trong pha động. Chúng có thể tích tụ trong máy bơm, cột hoặc máy dò. Làm tăng các đường cơ sở dao động và áp suất không ổn định.

Bạn có thể làm để loại bỏ khí hòa tan trong pha động, chẳng hạn như:

  • Sonication (hiệu quả cao nhưng bất tiện)
  • Lọc trong chân không (tương đối hiệu quả, loại bỏ các hạt vật lý nhưng có thể gây ô nhiễm)
  • Bộ khử khí trực tuyến (tùy chọn thuận tiện và được sử dụng rộng rãi nhất).

Để bảo vệ hệ thống HPLC và cột của bạn khỏi các hạt vật chất. Nhà sản xuất khuyên bạn nên lọc pha động trước khi sử dụng. Nhiệm vụ này có thể được thực hiện bằng các thiết bị lọc chân không đơn giản. Thêm tất cả các chất đệm và chất điều chỉnh trước khi lọc. Một chân không được áp dụng để kéo dung môi qua bộ lọc. Bộ lọc này cũng có tác dụng khử khí đồng thời pha động. Xử lý các bộ lọc bằng nhíp và đảm bảo bộ máy lọc luôn sạch sẽ.

Nylon 66 là vật liệu lọc tốt cho các pha động chứa nước. Trong khi PTFE là vật liệu lọc tuyệt vời cho hầu hết các dung môi hữu cơ. Màng vô cơ có khả năng chống lại sự phân hủy hóa học từ nhiều loại dung môi HPLC. Xin lưu ý rằng bộ lọc Teflon không thể sử dụng được với nước. Do đặc tính không phân cực của vật liệu.

Dung moi phan tich Merck
Sản phẩm hóa chấ của Merck

Yêu cầu lọc pha động HPLC luôn là chủ đề được tranh luận sôi nổi. Nó sẽ loại bỏ các hạt vật lý. Nhưng bạn có nguy cơ làm nhiễm bẩn pha động thông qua các hạt trên bộ lọc. Hoặc bề mặt của dụng cụ thủy tinh được sử dụng. Đồng thời có khả năng làm thay đổi độ pH. Thông qua sự bay hơi của các chất phụ gia điều chỉnh độ pH dễ bay hơi. Ví dụ: axit trifluoroacetic dễ bay hơi và có thể bị mất vào khí quyển trong điều kiện lọc chân không.

Chuẩn bị pha động

Việc chuẩn bị Pha động có thể được chia thành các bước chính sau:

  • Đo thể tích thích hợp của từng hóa chất pha động
  • Điều chỉnh độ pH của thành phần nước bằng dung dịch đệm
  • Thêm bất kỳ chất phụ gia cần thiết nào khác vào thành phần nước của pha động
  • Trộn dung môi (nếu cần cho hoạt động đẳng cấp)
  • Lọc pha động
  • Pha động Degas

Hầu hết các pha động là hỗn hợp của ít nhất hai hóa chất. Thể tích của từng loại phải được đo độc lập. Đồng thời điều chỉnh độ pH và thêm chất phụ gia vào thành phần nước. TRƯỚC KHI kết hợp các dung môi. Điều này tránh được các vấn đề liên quan đến thay đổi thể tích, khi trộn một số dung môi nhất định.

Hỗn hợp 60:40 nước:metanol (v:v) có thể sai tới 10% do ẩn nhiệt khi trộn. Ảnh hưởng đến thể tích tổng thể của dung dịch hỗn hợp. Việc trộn thường được thực hiện trực tiếp bởi hệ thống HPC. Giúp khắc phục các vấn đề khi trộn trước các thành phần pha động. Nhưng đòi hỏi phải sử dụng máy bơm hai hoặc bốn đắt tiền hơn như mô tả ở trên. Khi sử dụng bộ đệm trong phân tích gradient. Hãy đảm bảo rằng chúng hòa tan hoàn toàn trong phạm vi đầy đủ các thành phần pha động dự kiến.

Dung dịch rửa giải HPLC

Độ tinh khiết của dung môi cực kỳ quan trọng. Vì nó có thể ảnh hưởng đến độ nhạy đạt được của phép phân tích. Dung môi kém tinh khiết hơn có thể làm tăng mức nhiễu nền, cũng như tạo ra các đỉnh ma. Nên sử dụng dung môi HPLC của Merck hoặc dung môi tốt hơn. Dung môi cấp độ gradient ít có khả năng tạo ra các đỉnh ma khi sử dụng phương pháp phát hiện tia cực tím. Đối với máy phát hiện MS, đặc biệt nhạy cảm với tạp chất dung môi. Làm thay đổi hằng số điện môi của pha động. Do đó phản ứng của máy dò MS, đặc biệt là khi sử dụng chế độ ion hóa Electrospray cần dùng dung môi ‘MS Grade’.

Những nguyên tắc này cũng cần được áp dụng nghiêm ngặt đối với bất kỳ dung môi Nước. Và thường xảy ra trường hợp chất lượng nước sản xuất nội bộ không được kiểm soát đầy đủ, để duy trì chất lượng của dung dịch rửa giải. Điều này có thể dẫn đến lãng phí thời gian theo dõi nguồn gốc của các đỉnh ma. Và các đợt phân tích mẫu không thành công.

Các nhà sản xuất dung môi thường sẽ cung cấp nhiều loại nước để phân tích HPLC. Nhằm đảm bảo cho người dùng cuối về chất lượng của tất cả các thuốc thử được sử dụng để chuẩn bị pha động.

Cân nhắc về tia cực tím

Khi chọn hóa chất, bạn cũng phải xem xét độ hấp thụ tia cực tím của dung môi. Vì điều này có thể thay đổi từ loại này sang loại khác, tùy thuộc vào bản chất và nồng độ của tạp chất.

Dưới đây là một số ví dụ về giới hạn hấp thụ tia cực tím đối với nhiều loại dung môi HPLC phổ biến:

  • Isooctan: 197 nm
  • Cyclohexan: 200 nm
  • Tetraclometan: 265 nm
  • Propan-2-ol: 205 nm
  • Ethanol: 210 nm
  • Acetonitril: 190 nm
  • DMSO: 268 nm
  • Metanol: 205 nm

Bằng cách làm việc trên ngưỡng dung môi và thiết lập chính xác các đặc tính thu nhận của máy dò. Người ta có thể tránh được các vấn đề như tăng đường cơ sở trong quá trình phân tích và/hoặc giảm độ nhạy của máy dò.

Ngoài ra, khi sử dụng dung môi cấp thấp hơn, độ hấp thụ tăng từ các tạp chất có trong dung môi hoặc thùng chứa dung môi sẽ dẫn đến hiệu suất phân tích giảm, biểu hiện là độ tái lập của phương pháp bị ảnh hưởng và độ nhạy giảm.

Độ nhớt

Nhìn chung, các dung môi có độ nhớt thấp hơn sẽ cho các pic hẹp hơn do sự chuyển khối lượng của chất phân tích trong pha động được cải thiện. Độ nhớt cũng rất quan trọng khi xem xét áp suất ngược của hệ thống. Dung môi càng nhớt thì áp suất ngược của hệ thống càng cao.

Chỉ số khúc xạ

Máy dò chỉ số khúc xạ hoạt động bằng cách so sánh chỉ số khúc xạ của một tế bào tham chiếu chứa đầy pha động. Với chỉ số khúc xạ của pha động chứa chất phân tích. Sự chênh lệch chiết suất càng lớn thì nồng độ của các loài có mặt tại thời điểm đó càng lớn. Và tín hiệu đầu ra càng lớn. Sẽ đạt được giới hạn phát hiện tốt hơn nếu chiết suất của pha động thay đổi nhiều so với chiết suất của mẫu.

Điểm sôi

Quan trọng trong HPLC chuẩn bị. Dung môi có nhiệt độ sôi thấp sẽ dễ dàng loại bỏ (bằng cách bay hơi) khỏi mẫu.

3.Dung môi và lưu ý cho phân tích sắc ký LC-MS

Dung môi thường được chọn dựa trên độ hòa tan. Và khả năng tương thích của hợp chất được quan tâm với các kỹ thuật ion hóa khác nhau. Được sử dụng trong LC-MS. Tính dễ bay hơi và khả năng cho proton của dung môi rất quan trọng trong ESI và các kỹ thuật ion hóa khí quyển khác.

Chon dung moi phan tich dung

Các dung môi protic chính như Metanol và hỗn hợp với nước. Chẳng hạn như metanol/nước 1:1 hoặc axetonitril/H 2 O 1:1, được sử dụng. Mặc dù hỗn hợp nước/metanol làm tăng độ nhớt. Vượt xa cả nước hoặc metanol như một dung môi nguyên chất vì của phản ứng tỏa nhiệt. Áp suất hơi tương đối thấp của nước có thể gây bất lợi cho độ nhạy khi sử dụng ở mức 100%. Kết quả độ nhạy tốt hơn khi sức căng bề mặt giảm đi. Thông qua việc bổ sung dung môi hữu cơ dễ bay hơi. Các chất hoạt động bề mặt có ái lực proton cao hơn. Mặc dù chúng làm tăng sự giải phóng ion khỏi các giọt khí dung, nhưng cũng có thể làm giảm độ nhạy.

Các đồng dung môi không proton như 10% DMSO trong nước và rượu isopropyl. Giúp cải thiện khả năng hòa tan của một số hợp chất. Axit formic thường được thêm vào ở mức thấp (0,1%). Để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ion hóa. Bằng cách đảm bảo chất phân tích có tính bazơ hơn dung môi. Tuy nhiên, ngay cả với lượng nhỏ, một số axit, như TFA, mặc dù cần thiết cho các hợp chất không hòa tan nhưng có thể hạn chế độ nhạy.

Trong chế độ ion hóa ESI, chất đệm và muối (Na + , K + và photphat) làm giảm áp suất hơi và do đó làm giảm tín hiệu. Có thể khắc phục sức căng bề mặt tăng lên của các giọt và giảm độ bay hơi bằng cách sử dụng các chất đệm tương đối dễ bay hơi hơn như amoni axetat, được hình thành bởi cặp axit-bazơ yếu.

Cân nhắc về dung môi trong phân tích LC-MS

  • Việc loại bỏ hơi nước và dung môi khỏi vùng ion hóa sẽ làm tăng các loại hợp chất có thể bị ion hóa ở áp suất khí quyển.
  • Việc giảm thể tích chất lỏng so với mẫu hoặc chất phân tích quan tâm có trong chất lỏng sẽ cải thiện hiệu suất ESI (tức là tốc độ dòng chảy thấp hơn).
  • Dung môi hữu ích
    • Nước
    • Acetonitril
    • Metanol
    • Ethanol
    • Propanol
    • Isopropanol
  • Chất bổ sung được chấp nhận
    • Acid acetic
    • Axit formic
    • Ammonium hydroxide
    • Amoni formate (nồng độ muối = 10 mM hoặc ít hơn)
    • Amoni axetat (nồng độ muối = 10 mM trở xuống)
  • Các muối không bay hơi (photphat, borat, citrat, v.v.)
    • Có thể đọng lại trong nguồn và các mao mạch bịt kín. Do đó cần nhiều hoạt động vệ sinh và bảo trì hơn
    • Các thiết kế nguồn hiện đại có thể xử lý các chất không biến đổi tốt hơn các thiết kế cũ
  • Các chất hoạt động bề mặt (chất hoạt động bề mặt/chất tẩy rửa) ngăn chặn quá trình ion hóa phun điện
  • Axit vô cơ có tính ăn mòn
  • Axit trifloaxetic (TFA)
    • Ở một mức độ nào đó ngăn chặn quá trình phun điện ion dương ở mức vượt quá 0,01%.
    • Máy phun điện tử ion âm bị ức chế rất nhiều.
  • Trietylamin (TEA)
    • PA cao (232 Kcal/mol) tạo ra ion [M+H]+ cường độ cao ở  m/z  102
    • Ngăn chặn sự phun điện ion dương của các hợp chất kém cơ bản hơn.
  • Tetrahydrofuran (THF)
    • 100% THF rất dễ cháy nên APCI và hầu hết các kỹ thuật giao tiếp đều sử dụng nitơ làm khí phun sương. (Sử dụng không khí sẽ tạo ra nguy cơ nổ).
    • Phản ứng với ống PEEK.

Ức chế ion và lựa chọn hóa chất

Sự ức chế ion là một trong những vấn đề dễ thấy hơn mà các nhà quang phổ phải đối mặt khi sử dụng ESI (Khối phổ ion hóa phun tĩnh điện) làm kỹ thuật ion hóa. Ấn phẩm của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA),  Hướng dẫn Công nghiệp về Xác nhận Phương pháp Phân tích Sinh học (Federal. Register , 66, 100, 28526) năm 2001 đề cập lưu ý một số quy trình thử nghiệm để đánh giá sự hiện diện của  sự ức chế ion.

Người ta so sánh phản  ứng theo dõi nhiều phản ứng (MRM) (diện tích cực đại hoặc chiều cao cực đại) của chất phân tích trong mẫu sau chiết đã thêm chuẩn. Với mẫu của chất phân tích được bơm trực tiếp vào pha động nguyên chất. Tín hiệu chất phân tích thấp ở nền so với dung môi nguyên chất  cho thấy sự có mặt của  các thực thể gây nhiễu.

Một ấn phẩm của C. Mallet  et al . mô tả vị trí hiện diện  của ma trận sắc ký đồ đối với chất phân tích (và  chất chuẩn nội). Các nhà thí nghiệm sử dụng  dòng chảy liên tục của dung dịch chuẩn chứa chất phân tích quan tâm. Và chất chuẩn nội của nó được thêm vào dòng thải của cột. Sau khi bơm  dịch chiết mẫu trắng vào hệ thống LC. Sự sụt giảm trong  đường cơ sở không đổi cho thấy sự ức chế  ion hóa của chất phân tích do sự có mặt  của vật liệu gây nhiễu.

Cột sắc ký

Một sự thay đổi có thể thực hiện được trong công nghệ là sự ra đời của các cột hóa học lai và các hạt có tính chọn lọc cao có đường kính dưới 2 micromet. Các hóa chất lai ít phụ thuộc hơn vào các chất điều chỉnh pha động vì có thể gây ra sự ức chế ion và tăng tính chọn lọc của các hạt.

4. Dung môi hiệu suất cao cho phân tích HPLC và LC-MS của Merck