Cách Chọn Sắc Ký Lớp Mỏng (TLC) Phù Hợp

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là kỹ thuật phổ biến trong phân tích. Trong bài viết này chúng tôi sẽ cung cấp thông tin để chọn tấm TLC phù hợp.

Phụ Lục

Toggle

1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

1.1 Phân loại

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật phân tách các chất từ một chất khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh. Pha tĩnh được trải một lớp mỏng đồng nhất và được cố định ở các phiến kính hoặc một phiến kim loại.Pha động là hệ dung môi đơn lẻ hoặc đa thành phần được hòa trộn với nhau theo tỷ lệ qui định sẵn. Di chuyển trên một bản mỏng theo lực mao quản. Các phân tử trong hỗn hợp mẫu thử sẽ được di chuyển trên lớp mỏng. Qua lớp hấp phụ, , theo hướng của pha động với tốc độ khác nhau. Kết quả sẽ thu được một dải ảnh được gọi là sắc ký đồ.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography: HPTLC) là một dạng sắc ký lớp mỏng tiên tiến nhất. Phương pháp này xuất phát từ việc sử dụng pha tĩnh phân tách tối đa và các thiết bị đo đạc hiện đại trong trong qui trình phân tích. Yêu cầu của sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao cần chấm mẫu chính xác, vết chấm phải nằm trên bề mặt. Chuẩn hóa sắc ký có đạt được độ tái lặp cao và kết quả được đánh giá bằng phần mềm.

Sắc ký ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, thực phẩm, đồ uống, hóa chất, môi trường,.. Một số phương pháp sắc ký khác được sử dụng trong phòng thí nghiệm như: Sắc ký cột, Sắc ký giấy, Sắc ký khí, Sắc ký lỏng,…

1.2 Cơ chế sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng giống như tất cả các  phương pháp sắc ký khác: mỗi hợp chất sẽ có ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh (lớp silica gel hoặc alumina mỏng đồng nhất, phủ lên một mảnh thủy tinh, kim loại hoặc nhựa cứng). Pha động (chất lỏng hoặc chất khí). Pha động chảy qua pha tĩnh và mang theo các thành phần của hỗn hợp. Các thành phần khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau. Điều này tạo ra kết quả thu được của sắc ký lớp mỏng là các điểm màu phát quang phân tách rõ ràng.

Retention factor (Rf) – hệ số lưu giữ

Sau khi quá trình phân tách hoàn tất, các hợp chất riêng lẻ được xuất hiện dưới dạng các điểm và phân tách theo chiều dọc. Mỗi điểm có một hệ số lưu giữ (Rf) được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Công thức tính hệ số Rf là: Rf= Quãng đường mẫu đi được / Quãng đường dung môi đi được tính từ điểm chấm mẫu

Khi so sánh hai hợp chất khác nhau trong cùng điều kiện, hợp chất nào có khối lượng lớn hơn giá trị Rf sẽ ít phân cực hơn vì nó không bám vào pha tĩnh lâu như hợp chất phân cực.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến hệ số Rf như độ dày, độ ẩm trên bản TLC, độ bão hòa của bình, nhiệt độ, bản chất của bản TLC, cỡ mẫu và các thông số dung môi.

1.3 Thiết bị và dụng cụ thực hiện Sắc ký lớp mỏng

1.3.1 Tấm (Pha tĩnh)

Như đã đề cập trước đó, các bản TLC (hay còn được gọi là bản sắc ký) có thể được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm. Nhưng thường sẽ được chọn mua là nhiều nhất. Pha tĩnh phổ biến nhất là Silica gel và alumina, nhưng những loại khác cũng có sẵn.

Nhiều tấm kết hợp với một hợp chất phát huỳnh quang dưới tia cực tím bước sóng ngắn (254 nm). Mặt sau của các tấm TLC thường là thủy tinh, nhôm hoặc nhựa. Tấm kính cứng, trong suốt và có thể tái sử dụng có khả năng kháng hóa chất cao và ổn định nhiệt tốt khi đốt than. Vì những lý do này, chúng là tấm đỡ được sử dụng rộng rãi nhất.

Tấm lá nhôm là giải pháp thay thế hỗ trợ giúp dễ dàng xử lý và chống vỡ. Nhẹ và mỏng hơn tấm kính, tấm nhôm có thể giảm chi phí vận chuyển và tiết kiệm không gian lưu trữ. Ngoài ra, chúng có thể dễ dàng cắt bằng kéo theo kích thước mong muốn và dễ lưu trữ trong phòng thí nghiệm.

Các tấm đỡ bằng nhựa hoặc polyester (PET) cũng được sử dụng vì nhẹ và linh hoạt.

Làm cách nào để chọn các tấm TLC phù hợp?

Bảng so sách bên dưới sẽ cung cấp các thông tin ưu và nhược điểm của các tấm TLC:

Tấm	Ưu điểm	Nhược điểm
Thủy tinh	Cứng rắn Trong suốt Tiết kiệm chi phí (có thể tái sử dụng) Kháng hóa chất cao Được sử dụng phổ biến nhất Ổn định nhiệt độ	Dễ vỡ Không thể dễ dàng cắt theo kích thước mong muốn Nặng – chi phí vận chuyển cao Dày (>1,0 mm) – cần không gian kệ rộng hơn khoảng 5 lần so với các tấm có mặt sau bằng nhôm hoặc nhựa Mặt sau rất dễ bị vỡ (vấn đề an toàn tiềm ẩn)
Giấy nhôm	Dễ dàng xử lý/an toàn – chống vỡ Có thể dễ dàng cắt theo kích thước mong muốn bằng kéo Mỏng (~0,15 mm) – tiết kiệm không gian lưu trữ Nhẹ – chi phí vận chuyển thấp hơn Kháng dung môi Độ bám dính của lớp hấp phụ mạnh – tốt để sử dụng với chất rửa giải có chứa nồng độ cao Ổn định nhiệt tốt Có thể lưu vào sổ tay phòng thí nghiệm	Không thể tái sử dụng Không kháng hóa chất như thủy tinh đối với thuốc thử như axit vô cơ và amoniac đậm đặc
Nhựa (Polyester – PET)	Dễ dàng xử lý/an toàn – chống vỡ Có thể dễ dàng cắt theo kích thước mong muốn bằng kéo Mỏng (~0,2 mm) – tiết kiệm không gian lưu trữ Nhẹ – chi phí vận chuyển thấp hơn Kháng dung môi Có thể lưu vào sổ tay phòng thí nghiệm	Không thể tái sử dụng Độ ổn định nhiệt thấp hơn – phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn so với thủy tinh Lớp hấp phụ có thể dễ bị nứt hơn

Các tấm TLC có pha tĩnh như:

• Silica gel – chất hấp thụ phổ biến nhất. Dung dịch rửa giải được sử dụng như sử dụng cho HPLC. Không có chất xúc tác của alumina. Sản phẩm thông dụng như TLC Silica gel 60 F₂₅₄
• Oxit nhôm – chất hấp thụ TLC phổ biến thứ hai.
• Cellulose – có sẵn ở dạng cellulose vi tinh thể hoặc sợi. Lớp xenlulô vi tinh thể có các vết nhỏ hơn so với lớp xenlulô dạng sợi.
• Polyamide – độ khuếch tán thấp, cho phép các điểm mẫu giới hạn với cường độ tối đa.

Pha tĩnh	Cơ chế sắc ký	Ứng dụng tiêu biểu
Gel silica	Hấp phụ	steroid, axit amin, rượu, hydrocacbon, lipid, aflaxtoxin, mật, axit, vitamin, alkaloid
Silica gel RP	Pha ngược	axit béo, vitamin, steroid, hormone, caroten
Cellulose, kieselguhr	Vách ngăn	cacbohydrat, đường, rượu, axit amin, axit cacboxylic, axit béo
Oxit nhôm	Hấp phụ	amin, rượu, steroid, lipid, aflatoxin, axit mật, vitamin, alkaloid
Xenlulô PEI	Trao đổi ion	axit nucleic, nucleotide, nucleoside, purin, pyrimidine
Magiê silicat	Hấp phụ	steroid, thuốc trừ sâu, lipid, alkaloid

Tùy theo đặc tính của mẫu mà chúng ta chọn pha tĩnh phù hợp. Chúng tôi cung cấp nhiều lựa chọn các tấm TLC phân tích tiêu chuẩn.

HPTLC mang lại những lợi thế khác biệt hơn TLC. Như khả năng phân giải tốt hơn, thời gian phân tách nhanh, khuếch tán mẫu thấp hơn. Và giảm mức tiêu thụ dung môi. Các bản HPTLC có sẵn được phủ nhiều loại chất nền khác nhau và có hoặc không có chất chỉ thị. Bản sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) đặc trưng bởi các hạt nhỏ hơn 10 µm, các lớp mỏng nhỏ hơn 200 µm.

1.3.2 Chất kết dính

Chất kết dính không ảnh hưởng đến các đặc tính hấp phụ của ma trận. Nhưng chúng ảnh hưởng đến sự kết dính của lớp chất hấp phụ với lớp nền. Chất kết dính sẽ gồm:

• Chất kết dính polyme (hữu cơ) – có các lớp hấp phụ chứa chất kết dính polyme thường chắc chắn nhất. Giúp cho việc xử lý và ứng dụng phân tích mẫu dễ dàng hơn. Chúng cũng cho phép sử dụng hàm lượng nước cao hơn trong dung môi sử dụng. Chúng thường được khuyến nghị cho tất cả các ứng dụng TLC ngoại trừ những ứng dụng sử dụng tính năng tạo than để trực quan hóa.
• Chất kết dính vô cơ: Tấm có các lớp hấp phụ chứa chất kết dính vô cơ không chắc chắn như tấm có chất kết dính hữu cơ. Nhưng nhìn chung chắc chắn hơn tấm không có chất kết dính hoặc có chất kết dính thạch cao. Chúng có khả năng chống nước cao nhất và tương thích với các thuốc thử dạng nước. Chất kết dính vô cơ thường được sử dụng cho các bản TLC chuẩn vì chúng mềm. Cho phép dễ dàng bỏ các điểm chứa phân tử mục tiêu khỏi chất hỗ trợ rửa giải và phục hồi.
• Thạch cao – tấm sử dụng chất kết dính thạch cao thường ít chắc chắn nhất và dễ gãy. Chúng không được khuyến cáo sử dụng với dung môi chứa hơn 20% nước. Giống như các tấm có các lớp vô cơ, chúng cho phép dễ dàng loại bỏ các điểm chứa phân tử mục tiêu khỏi chất hỗ trợ cho quá trình rửa giải và thu hồi. Được khuyên dùng cho các ứng dụng yêu cầu hóa than để hiển thị.

  1.3.3 Dung môi (Pha động)

Lựa chọn dung môi thích hợp có lẽ là khía cạnh quan trọng nhất của sắc ký lớp mỏng. Một dung môi phổ biến là 1:1 hexan:etyl axetat. Việc thay đổi tỷ lệ có thể có tác động rõ rệt đến giá trị Rf nằm trong khoảng từ 0 đến 1. Với 0 biểu thị độ phân cực của dung môi rất thấp. Và 1 biểu thị độ phân cực của dung môi rất cao.

Khi thực hiện thử nghiệm sắc ký lớp mỏng, bạn không muốn các giá trị của mình là 0 hoặc 1. Vì các thành phần mà bạn đang tách có các cực khác nhau. Nếu giá trị bằng 0, bạn cần tăng độ phân cực của dung môi. Vì mẫu không chuyển động và dính vào pha tĩnh. Nếu giá trị là 1, bạn cần giảm độ phân cực của dung môi vì hợp chất không thể tách rời.

Nếu bạn biết rằng một thành phần của hỗn hợp không hòa tan trong một dung môi nhất định. Nhưng một thành phần khác hòa tan tự do trong đó, thì nó thường cho phép phân tách tốt. Tốc độ các hợp chất di chuyển lên tấm phụ thuộc vào hai điều:

• Nếu hợp chất hòa tan trong dung môi, nó sẽ di chuyển xa hơn lên tấm sắc ký lớp mỏng
• Nếu hợp chất thích pha tĩnh, nó sẽ dính vào nó, điều này sẽ khiến nó không di chuyển xa trên sắc ký đồ.

Axit, bazơ và các hợp chất phân cực mạnh:

Thường tạo ra các vệt rõ hơn là các vết trong dung môi trung tính. Các vệt gây khó khăn cho việc tính (Rf) và thậm chí nó còn che lấp các điểm khác. Thêm một vài phần trăm axit axetic hoặc axit formic vào dung môi. Có thể khắc phục hiện tượng sọc bằng axit. Nước hiếm khi được sử dụng làm dung môi vì nó tạo ra mặt trước đường cong không đồng đều. Nguyên nhân là do sức căng bề mặt của nó.

Tương tự như vậy đối với bazơ, thêm một vài phần trăm triethylamine có thể cải thiện kết quả. Đối với các hợp chất phân cực, thêm một vài phần trăm metanol cũng có thể cải thiện kết quả.

Độ bay hơi của dung môi cũng cần được xem xét khi sử dụng. Bất kỳ dung môi nào còn lại trên đĩa cũng có thể gây ra các phản ứng . Nhiều dung môi có thể được loại bỏ bằng cách để yên trong vài phút, nhưng những dung môi rất khó bay hơi có thể cần thời gian trong buồng chân không. Dung môi dễ bay hơi chỉ nên được sử dụng một lần. Nếu pha động được sử dụng nhiều lần, kết quả sẽ không nhất quán hoặc không thể lặp lại. Hỗn hợp dung môi hữu ích:

• Dung môi có thể dùng để tách hỗn hợp các hợp chất phân cực mạnh là etyl axetat : butanol : axit axetic : nước, 80:10:5:5.
• Để tách các thành phần bazơ mạnh, tạo hỗn hợp 10% NH ₄ OH trong metanol, sau đó tạo hỗn hợp 1 đến 10% này trong dichlormethane.
• Hỗn hợp 10% metanol hoặc ít hơn trong DCM có thể hữu ích để tách các hợp chất phân cực.

1.3.4 Pipet

Các điểm được chấm lên tấm TLC bằng cách sử dụng pipet thủy tinh rất mỏng. Mao quản phải đủ mỏng để thực một điểm gọn gàng. Nhưng không quá mỏng để ngăn cản sự hấp thu đủ lượng chất phân tích.

1.3.5 Bình chạy sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị bình chạy sắc ký: Các bình thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ. Có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi vào khí quyển trong bình. Bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc. Còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Đậy kín nắp bình và để yên 1 h ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết. Loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ bị biến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp, phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi. Sẽ làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị sốRf.

1.3.6 Các dụng cụ khác

• Đèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.
• Dụng cụ để phun thuốc thử.
• Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
• Tủ hút hơi độc.
• Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
• Một máy ảnh tốt có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30 cm đến 50 cm.
• Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
• Micropipet nhiều cỡ từ 1 μl, 2 μl, 5 μl, 10 μl đến 20 μl, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.
• Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp.
• Giá để xếp các tấm kính đã trải.

1.4 Triển khai sắc ký lớp mỏng

Tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng theo các bước cơ bản sau:

1. Cắt tấm TLC theo đúng kích thước và dùng bút chì (không bao giờ dùng bút mực), nhẹ nhàng vẽ một đường thẳng trên đĩa cách đáy khoảng 1 cm. Không sử dụng lực quá mạnh khi viết trên tấm TLC vì điều này sẽ loại bỏ pha tĩnh. Điều quan trọng là sử dụng bút chì thay vì bút mực vì mực thường di chuyển lên đĩa cùng với dung môi.
2. Sử dụng pipet, bôi các điểm chất phân tích lên vạch. Đảm bảo có đủ mẫu trên đĩa. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng tia cực tím sóng ngắn. Một điểm màu tím nên được nhìn thấy. Nếu vết không nhìn thấy được, cần thêm nhiều mẫu hơn vào đĩa. Nếu có sẵn chất chuẩn của hợp chất mục tiêu, thì nên tạo ra một vết đồng màu bằng cách chấm chất chuẩn lên một vết của hỗn hợp chưa biết.
3. Đặt đĩa vào trong buồng càng đều càng tốt và tựa nó vào một bên. Không bao giờ cho phép dung môi lớn vượt quá vạch bạn đã vẽ. Cho phép hoạt động mao dẫn hút dung môi lên trên tấm cho đến khi nó cách điểm cuối khoảng 1 cm. Không bao giờ để dung môi di chuyển hết đến cuối đĩa.
4. Lấy đĩa ra và ngay lập tức vẽ một đường bút chì trên mặt dung môi.
5. Sử dụng đèn UV bước sóng ngắn và khoanh tròn các thành phần được hiển thị bằng bút chì.

1.5 Phát hiện

Khi quá trình triển khai sắc ký lớp mỏng hoàn tất, cần phải có hình ảnh trực quan của các vết trên sắc ký đồ để phát hiện và đánh giá kết quả. Nhiều hợp chất có hấp thụ ánh sáng UV hoặc có đặc tính huỳnh quang khi bị kích thích bởi tia cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy thì có thể phát hiện trực tiếp. Nhưng hầu hết các hợp chất không có màu rõ ràng nên phải sử dụng thuốc thử thích hợp để hiện màu. Số lượng thuốc thử phát hiện khi phân tích bằng Sắc ký lớp mỏng rất lớn điều đó phản ánh tính linh hoạt của kỹ thuật phát hiện.

Iodine (Iốt)  là một trong những thuốc thử phổ biến nhất. Hầu hết các hợp chất hữu cơ sẽ bị nhuộm màu nâu tạm thời. Một số thuốc thử được sử dụng như là Permanganat, ceric ammonium molybdate (CAM) và p-anisaldehyde.

3. Ưu điểm và nhược điểm của Sắc ký lớp mỏng và Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

3.1 Ưu điểm

Sắc ký lớp mỏng và Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong phân tích. Cho nhiều đối tượng thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau. Ưu điểm của chúng là:

• Bản mỏng hiện có sẵn trên thị trường nên dễ dàng triển khai phân tích
• Có thể thực hiện điều chế và thu được chất tinh khiết nhanh chóng, đơn giản
• Thời gian phân tích thấp hơn và chi phí cho mỗi mẫu phân tích ít hơn
• Các bước chuẩn bị mẫu đơn giản – ít gặp vấn đề về nền mẫ. Không cần trình độ cao đối với người phân tích
• Phân tích đồng thời các mẫu thử và chuẩn – độ chính xác, hiếm khi cần chuẩn nội
• Không cần xử lý trước đối với dung môi như lọc và khử khí
• Tiêu thụ dung môi ở pha động ít cho mỗi mẫu nên thân thiện với môi trường
• Không chịu sự ảnh hưởng từ lần phân tích trước. Pha tĩnh và pha động luôn mới cho mỗi lần phân tích, không có nhiễm chéo
• Có thể phát hiện với nhiều chế độ khác nhau đặc hiệu cho mỗi nhóm chất
•  Tài liệu hóa dễ dàng
• Chi phí bảo trì thấp

3.2 Nhược điểm

Bên cạnh đó phương pháp Sắc ký lớp mỏng cũng có những nhược điểm như:

• Độ tái lập có thể không đạt được nếu điều kiện độ ẩm không được kiểm soát tốt
• Do hệ thiết bị Sắc ký lớp mỏng đơn giản nên đa số chỉ có thể định tính chứ không thể định lượng được
• Yêu cầu có chất chuẩn để làm chuẩn
• Độ nhạy bị ảnh hưởng do lượng mẫu thực hiện phân tích nhỏ.

4. Ứng dụng sắc ký lớp mỏng trong kiểm nghiệm thuốc

Sắc ký lớp mỏng cùng với sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là hai phương pháp được áp dụng nhiều trong phân tích của ngành dược phẩm, hóa học lâm sàng, hóa học pháp y, hóa sinh. Một số ngành khác như mỹ phẩm, phân tích thực phẩm, phân tích môi trường.

Trong kiểm nghiệm thuốc Sắc ký lớp mỏng được sử để theo dõi quá trình phản ứng của tổng hợp thuốc. Định tính và xác định độ tinh khiết của nguyên liệu, thành phẩm thuốc. HPTLC với hệ thống trang thiết bị đồng bộ, độ chính xác cao cho phép định tính và cả định lượng để tiêu chuẩn hóa thuốc nguyên liệu và thành phẩm.

4.1 Định tính

Nguyên liệu và các thành phẩm thuốc có nền mẫu tương đối đơn giản. Hơn nữa qui trình phân tích bằng sắc ký lớp mỏng trong Dược điển đã ổn định. Do đó TLC được sử dụng trong hầu hết các phép thử định tính của đối tượng này. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao rất ít khi được dùng để định tính thành phẩm thuốc hóa dược. Nguyên tắc định tính bằng sắc ký lớp mỏng, mẫu thử được thực hiện song song với mẫu chuẩn và so sánh khoảng cách (R) chúng di chuyển với khoảng cách của chất đối chiếu đã biết. Màu sắc vết trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử phải được thực hiện song song, nếu trùng nhau thì được coi là dương tính.

Đối với phép sắc ký thực hiện trên hệ thống Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có bộ phận quét phổ (scanner), còn có thể tiến hành quét phổ hấp thụ UV – Vis tại vị trí vết chất phân tích trên sắc ký đồ để định tính. Khi định tính bằng HPLC – DAD, bộ phận scanner vừa có khả năng quét phổ trong vùng UV – Vis, đồng thời có thể thực hiện chồng phổ của vết chất phân tích.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có ưu điểm hơn với sắc ký lớp mỏng là có thể tách riêng chất phân tích ra khỏi các chất khác trong hỗn hợp với độ chọn lọc cao. Do đó một số dược điển như USP yêu cầu định tính sử dụng bản mỏng HPTLC.

4.2 Xác định tạp chất

Định danh tạp chất đã biết được xác định dựa vào so sánh với Rf của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng. Khi đánh giá kết quả thường là phép thử giới hạn cũng có thể là định lượng. Đánh giá kết quả căn cứ vào đậm độ về màu sắc của vết chất phân tích tách ra trên sắc đồ. Đối với sắc ký lớp mỏng cường độ vết được phát hiện bằng mắt. Còn trong sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, vết chất phân tích được chuyển thành dạng pic với thông số diện tích hoặc chiều cao pic tương tự HPLC. Sắc ký đồ chuyển từ dạng vết sang dạng pic trong sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được gọi là sắc ký đồ dạng pic hay sắc ký đồ analog.

Để xác định giới hạn tạp chất bằng sắc ký lớp mỏng thường thực hiện theo 2 cách như sau:

Pha loãng dung dịch thử

Yêu cầu phép phân tích là phải phát hiện được vết trong sắc ký đồ. Do đó, thường so sánh cường độ vết thu được của dung dịch mẫu thử với dung dịch pha loãng của chất kiểm tra. Mẫu thử được chuẩn bị ở mức nồng độ cao, mẫu đối chiếu sẽ được pha loãng với mẫu thử đến mức giới hạn (mẫu đối chiếu cũng có thể mẫu pha từ chất chuẩn ở mức nồng độ giới hạn). Mẫu thử được phân tích ở nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả các tạp. Mẫu đối chiếu ở nồng độ thấp nhằm đảm bảo độ tuyển tính của hoạt chất. Đáp ứng của hoạt chất có trong mẫu có nồng độ thấp tương tự tạp chất liên quan có nồng độ cao.

Một số thuốc thử tạo dẫn xuất trong phân tích dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng :

Sử dụng chất chuẩn

Nồng độ các tạp chất được xác định dựa trên cường độ vết của tạp trong mẫu thử  và đáp ứng của chuẩn tạp tương ứng. Thông thường, nồng độ dung dịch chuẩn tạp được chuẩn bị ở mức giới hạn cho phép của tạp đó. Khi tiến hành xác định tạp chất, cần chú ý đến độ nhạy của phương pháp và khả năng tách của hệ thống.

Sắc ký lớp mỏng thường chỉ được ứng dụng trong định tính, hầu như không được sử dụng trong định lượng nói chung và đối tượng thuốc nói riêng.

Còn Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với những cải tiến nhằm tăng độ phân giải của quá trình tách, đảm bảo độ tái lặp cũng như độ đúng của phép thử cho phép ứng dụng rộng rãi trong phân tích định lượng các chất. Việc sử dụng các thiết bị hiện đại như: máy quét, máy đo mật độ vết. Điều kiện buồng sắc ký được kiểm soát, chất hấp phụ đa dạng về chủng loại có độ phân giải cao. Kích thước hạt nhỏ và đồng đều, khả năng kết nối với các thiết bị phát hiện khác nhau. Cùng với sự phát triển của các chương trình phần mềm để thu và xử lý số liệu giúp cho sắc ký lớp mỏng trở thành một phương pháp thay thế HPLC hoặc sắc ký khí.

Việc sử dụng Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được đánh giá cao và được chấp nhận trên toàn thế giới. Ngày càng có nhiều công bố các nghiên cứu sử dụng HPTLC trong định lượng thuốc đã được đăng tải. Bao gồm kiểm tra chất lượng trong quá trình sản xuất, theo dõi độ ổn định, thậm chí trong lâm sàng.

5. Kết luận

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và hiệu quả. Do đó được ứng dụng rộng rãi phân tích nhiều loại đối tượng mẫu khác nhau. Qua thời gian, nó đã chứng minh được độ tin cậy của kết quả thử nghiệm và được công nhận là phương pháp thường qui để định tính, thử tinh khiết trong kiểm nghiệm thuốc hóa dược, dược liệu.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là một dạng sắc ký lớp mỏng tiên tiến nhất với việc sử dụng pha tĩnh có hiệu quả phân tách tối đa. Thiết bị đo đạc hiện đại cho tất cả các bước trong qui trình phân tích. Cho phép giải quyết tất cả các yêu cầu phân tích bao gồm định tính, thử tinh khiết và định lượng phù hợp với các chuẩn mực qui định về phương pháp phân tích như ICH, AOAC.

Tài liệu tham khảo

1. Touchstone, Joseph C. Practice of thin layer chromatography. 2nd ed. New York: Wiley, 1983.Print.
2. Geiss, Friedrich. Fundamentals of thin layer chromatography planar chromatography. Heidelberg: A. Hüthig, 1987. Print.
3. Touchstone, Joseph C. Practice of thin layer chromatography. 3rd ed. New York: Wiley, 1992. Print.
4. Figures: “Thin layer chromatography -.” Wikipedia, the free encyclopedia. Web. 03 Dec. 2009. <http://en.wikipedia.org/wiki/Thin_la…chromatography>.