Thuốc là một sản phẩm không thể thiếu trong cuộc sống hiện nay. Sản xuất thuốc là một quy trình vô cùng nghiêm ngặt và đòi hỏi tuân các tiêu chuẩn GMP trong sản xuất thuốc. Hãy cùng HBC tìm hiểu để đưa ra thành phẩm thuốc chúng ta cần trãi qua những quy trình nào và các sản phẩm nào của Corning được sử dụng để tối ưu được việc kiểm soát chất lượng thành phẩm.

Quy trình hoạt động của nhà máy sản xuất Sinh Dược

Ngày càng có nhiều loại bệnh xuất hiện từ động vật cho đến con người. Đó là một phần lý do vì sao hiện nay có rất nhiều loại thuốc mới được nghiên cứu và sản xuất.

Để sản xuất được một sản phẩm dược phẩm ra thị trường thì cả hệ thống sản xuất phải đáp ứng được các tiêu chuẩn khắt khe, trong đó tiêu chuẩn không thể thiếu là tiê u chuẩn GMP.

Các điều kiện để được sản xuất thuốc là: Cơ sở sản xuất cần có địa điểm phù hợp, nhà xưởng, phòng kiểm nghiệm, kho bảo quản, hệ thống phụ trợ đạt yêu cầu tiêu chuẩn. Các trang thiết bị máy móc, hệ thống bảo quản chất lượng, tài liệu chuyên môn kỹ thuật và nhân sự đáp ứng được yêu cầu Thực hành tốt sản xuất (GMP)

Quy trình hoạt động của một nhà máy thuốc Sinh dược như thế nào?

Sau khi đã xác định rõ danh mục, quy cách sản phẩm dự án sẽ sản xuất, định hướng phát triển của doanh nghiệp trong tương lai, doanh nghiệp cần lựa chọn các công nghệ, thiết bị sản xuất, kiểm nghiệm phù hợp. Đảm bảo tính thống nhất của hệ thống, tối ưu hóa chi phí đầu tư và mang lại những hiệu quả lâu dài trong quá trình hoạt động của dự án. Trong bài viết này, HBC sẽ đưa ra một vài sản phẩm từ thương hiệu Corning dành cho nuôi cấy tế bào, giúp bạn có được cái nhìn tổng quan và đưa ra lựa chọn phù hợp cho quá trình nghiên cứu và sản xuất dược phẩm của mình.

Ứng dụng nuôi cấy tế bào – Bioprocess

Bioprocess là quá trình sử dụng tế bào sống nguyên vẹn hoặc thành phần  tế bào nhằm thu được sản phẩm mong muốn. Ứng dụng chính của Bioprocess:

• Nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học
• Liệu pháp tế bào
• Liệu pháp gen
• Phát triển các vaccine và hoạt chất sinh học

Ứng dụng công nghệ tế bào – Quy trình chung:

Scale up

Scale Up là quá trình nâng dần thể tích nuôi cấy bằng cách tăng dần thể tích bình nuôi lớn hơn từ bình nuôi kích thước nhỏ ban đầu.  Trong quy trình công nghệ sẽ ứng với bước  nuôi mở rộng – Innoculation

Scale Out

Scale Out là quá trình nhân rộng lượng sản phẩm bằng cách tăng số lượng bình nuôi kích thước lớn sau quá trình Scale Up. Trong quy  trình sẽ tương ứng với bước sản xuất –  Production

Trong nuôi cấy tế bào gồm hai Kỹ thuật chính là nuôi cấy bám dính và huyền phù

Nuôi cấy tế bào bám dính (Adherent culture)

• Sản phẩm hay sử dụng: chai tầng, chai lăn, microcarrier, hệ nuôi nền cố định

Nuôi cấy tế bào huyền phù (Suspension culture)

• Sản phẩm hay sử dụng: bình lắc Erlenmayer, bình spinner, bioreactor kim loại (tank khuấy, sục khí) hoặc bioreactor dùng một lần (túi)

Ưu và nhược điểm của hai phương pháp này là:

Sản phẩm Corning dành cho nuôi cấy tế bào:

• Chai nuôi cấy (Flask)
• Đĩa nuôi cấy (Dish)
• Khay (Plate)
• Bình Hyper Flask
• Dụng cụ thu hoạch tế bào (Scraper & Lifter)
• Sản phẩm bảo quản lạnh
• Bình CellStack
• Bình HyperStack
• Bình Spinner, Chai lăn, Bình lắc,…

Các công nghệ cho sản phẩm nuôi cấy tế bào của Corning

• Bề mặt không xử lý (Non Treated): nuôi cấy huyền phù
• Bề mặt độ bám dính cực thấp (Ultra Low Adherent – ULA): nuôi cấy huyền phù
• Bề mặt xử lý Tissue Culture Treatment (TCT): nuôi tế bào bám dính
• Bề mặt xử lý công nghệ CellBIND: nuôi tế bào bám dính

Vật liệu sử dụng cho các chai – bình nuôi cấy: Polystyrene

• Ưu điểm: dễ đúc – trong suốt – rẻ
• Nhược điểm: không tích điện – không ưa nước => tế bào khó bám

Phương pháp xử lý bề mặt chai nuôi tế bào giúp tăng cường bám dính

1.Phương pháp vật lý làm thay đổi cấu trúc nhựa Polystyrene sau khi đúc  sản phẩm

2.Phương pháp phủ bề mặt nuôi cấy tế bào bằng các protein hoặc phân  tử tổng hợp khác

Phương pháp xử lý vật lý bề mặt:

• Tăng tích điện
• Tăng tính ưa nước

Cấu trúc sản phẩm sau khi được sử lý

Quy trình tế bào

Seed – tế bào bảo quản lạnh sâu. Các vật tư thiết bị cần có:

• Tế bào
• Môi trường – huyết thanh
• Bình – chai nuôi tế bào
• Đĩa => khay => chai nuôi => chai nuôi nhiều tầng => HyperFlask => CellStack => HyperStack
• Chuẩn bị bề mặt hỗ trợ bám dính tế bào: CellBIND – Biocoat – PureCoat – ECM
• Dụng cụ thao tác: bộ lọc, pipet, …

Quy trình nuôi cấy tế bào  mở rộng

Thể tích chai nuôi cấy tế bào đang có trên thị trường:

Chai nuôi cấy tế bào CellStack là chai nuôi cấy tế bào phục vụ việc mở rộng công suất nuôi cấy tế bào một cách thuận tiện. Sản phẩm đã được kiểm tra đầy đủ với các sản phẩm nuôi cấy tế bào. Sản phẩm có 5 lựa chọn kích thước cho các yêu cầu công suất khác nhau.

Đặc điểm chính

• Cấu tạo 10 lớp
• Diện tích gấp 10 lần (1720cm2)
• Sản lượng tế bào ~ 10 chai 175cm2
• Tiết kiệm thời gian – không gian
• Có thể quan sát tế bào ở 2 lớp trên và 2 lớp dưới.

• Bề mặt không xử lý hoặc xử lý CellBIND
• Tất cả chất lỏng được đưa vào – ra qua chung môt đường

• Đáy mỗi lớp bề mặt có màng thấm khí cho phép trao đổi khí

• Khoảng không gian giữa các lớp bề mặt nuôi cấy cho phép không khí được đi qua

Nhược điểm chai cấy tế bào đa tầng – HyperFlask

• Không dùng phương pháp cơ học để thu hoạch tế bào được
• Không quan sát được hết các lớp tếbào
• Bị nhiễm sẽ phải bỏ cả mẻ

Ưu điểm chai cấy tế bào đa tầng – HyperFlask

• Chai cấy nhiều tầng giúp tăng diện tích nuôi cấy/thể tích
• Giảm số lượng tủ ấm phải sử dụng
• Sử dụng để nhân nuôi tế bào để ứng dụng cho liệu pháp gene –liệu pháp tế bào và sản xuất vaccine

Đĩa nuôi cấy tế bào dạng nhiều giếng

• Dùng cho nuôi cấy tế bào sơ cấp
• Tách dòng
• Thử nghiệm Cell Assay

Đặc điểm chính

• Polystyrene
• Vô trùng SAL 10-3
• Non-Pyrogenic
• TSE/BSE Free

Các tùy chọn cấu tạo

• Đĩa 6-12-24-48-96 và 96 ½

Bề mặt

• TCT, CellBIND, Osteo assay
• Non-Treated, ULA

Ống bảo quản lạnh  – Cryotubes

Ống Cryotube ren vặn nắp bên ngoài:

• Giảm nguy cơ tạp nhiễm mẫu
• Doăng silicon chống rò rỉ giúp bảo vệ mẫu an toàn

Ống Cryotube ren vặn nắp bên trong

• Đường kính ngoài của nắp và ống như nhau giúp tối đa không gian

• Độ an toàn đảm bảo

1. COA (Certificate Of Analysis) là gì?

2. Giấy chứng nhận COA thể hiện những nội dung gì?

Theo nội dung có trong giấy COA, người sử dụng có thể biết được các thông tin sau:

– Hạn sử dụng và ngày thử lại: Thông qua thông tin Hạn sử dụng trên COA, người sử dụng biết được thời gian chất lượng sản phẩm đảm bảo cho kết quả tin cậy. Ngày thử lại được xem là ngày mà hãng sản xuất/ người sử dụng cần kiểm ra và đánh giá lại chất lượng sản phẩm. Các giá trị phân tích sẽ cho biết sự ảnh hưởng và chất lượng của sản phẩm trong thời gian tiếp theo.

– Thành phần và độ tinh khiết/ nồng độ của mẫu: COA giúp xác minh quá trình phân tích mẫu và cung cấp kết quả để người sử dụng kiểm tra có phù hợp với mục đích.

– Chứng nhận nguồn gốc: Trên COA, nhà sản xuất sẽ ghi chép đầy đủ thông tin các thiết bị được dùng để truy xuất nguồn gốc. Cách thức tiến hành thử nghiệm tiêu chuẩn. Và tiêu chuẩn được áp dụng trong quá trình sản xuất, phân tích.

3. Cách lấy COA và kiểm tra hạn sử dụng

Cách kiểm tra COA và hạn sử dụng của chất chuẩn LGC:

Cách kiểm tra COA và hạn sử dụng của chất chuẩn TRC:

Cách kiểm tra COA và hạn sử dụng của chất chuẩn ChemService:

Cách kiểm tra COA và hạn sử dụng hóa chất Merck:

4. Kết luận

Việc kiểm tra COA để nắm được thông tin về hạn sử dụng, nồng độ, thành phần và hàm lượng chất phân tích là điều rất cần thiết để có thể quyết định lựa chọn sản phẩm phù hợp. HBC hy vọng các thông tin trên đây sẽ hỗ trợ được khách hàng tìm kiếm thông tin khi cần thiết.

1. Các cấp bậc phân chia của hóa chất theo độ tinh khiết

Để đơn giản hóa việc tìm kiếm sản phẩm của bạn, danh mục sản phẩm vô cơ và vô cơ của Supelco®, dung môi được chia thành ba loại: EMSURE®, EMPARTA® và EMPLURA®. 

	Quy định	Cấp độ MQ*	Tài liệu đính kèm	Độ tinh khiết
EMSURE®	ACS ISO Reag. Ph Eur	MQ300	CoA, MSDS, BSE/TSE certificates,	99.7– 99.9%
EMPARTA®	ACS	MQ200	CoA’s MSDS BSE/TSE certificates	99.0– 99.5%
EMPLURA®	–	MQ200	CoA’s MSDS	~ 99%

2. Lựa chọn dung môi cho HPLC

Phương pháp Sắc ký là một quá trình tách chất phân tích ra khỏi hỗn hợp bằng cách sử dụng:

• Pha tĩnh: Chất phân tích được phân chia và được giữ lại
• Pha động: Phân chia các chất phân tích khỏi pha tĩnh và vận chuyển chúng qua lớp pha tĩnh

Các chất phân tích sẽ có ái lực hóa học khác nhau. Đối với từng pha, những chất có ái lực ít hơn với pha tĩnh sẽ rửa giải sớm hơn. Và những chất có ái lực lớn hơn sẽ rửa giải muộn hơn, do đó sẽ đạt được sự phân tách. Các hóa chất được sử dụng cho pha động và tỷ lệ sử dụng chúng có thể được điều chỉnh để thay đổi ái lực tương đối của chất phân tích. Dẫn đến thay đổi thời gian lưu và độ chọn lọc (khả năng tách hóa học) của quá trình phân tách.

Ảnh hưởng của độ phân cực dung môi đến quá trình phân tách HPLC và độ tinh khiết của dung môi cho các chế độ lưu khác nhau.

Dung môi và rửa giải

Để dự đoán thứ tự rửa giải của chất phân tích, chúng ta cần biết loại cột sắc ký mà chúng ta đang sử dụng và độ phân cực của dung môi pha động so với loại chất phân tích.

Thông thường, để đạt được sự phân tách mong muốn/ cần thiết. Phải sử dụng hỗn hợp các dung môi pha động và quy tắc đầu tiên là các dung môi này PHẢI có thể trộn được. Biểu đồ khả năng trộn lẫn của hóa chất có thể được sử dụng để xác định xem hai dung môi có thể trộn được với nhau hay không.

Dung môi phân cực  và tính chất hóa học

Có nhiều yếu tố kiểm soát  khả năng phân tách của hệ thống sắc ký. Bao gồm bản chất của dung môi pha động, độ pH của pha động. Cũng như tính chất và cường độ ion của bất kỳ chất đệm nào được sử dụng. Ví dụ, trong HPLC pha đảo, người dùng thường chọn Acetonitril hoặc Metanol (hoặc hỗn hợp của cả hai). Với nước làm thành phần pha động chính khác.

Metanol và acetonitril có các tính chất cơ bản khác nhau về mômen lưỡng cực, độ axit và tính bazơ. Do đó sẽ tạo ra sự phân tách có khả năng phân tách khác nhau. Bằng cách trộn các tỷ lệ khác nhau của các hóa chất này. Hoặc bằng cách sử dụng các cấu hình gradient khác nhau. Độ chọn lọc của quá trình phân tách có thể được ‘điều chỉnh’ để tạo ra độ phân giải tốt nhất giữa các chất phân tích.

Trong HPLC pha đảo, lượng dung môi hữu cơ so với thành phần nước thường thấp hoặc bắt đầu ở mức thấp. Sau đó tăng lên trong quá trình tách gradient. Trong sắc ký tương tác ưa nước (HILIC) thì sẽ ngược. Trong sắc ký pha thông thường, hai dung môi hữu cơ được sử dụng. Một hóa chất có ái lực hóa học cao hơn với pha tĩnh so với hóa chất kia. Do đó được sử dụng để thay thế các chất phân tích và hoạt động giống như chất biến tính hữu cơ trong sắc ký pha đảo.

Chọn đúng dung môi và thu được tỷ lệ dung môi chính xác là kỹ năng quan trọng trong việc phát triển phương pháp HPLC. Yếu tố quan trọng tiếp theo cần xem xét là dung môi sẽ được bơm như thế nào. Và có thể được trộn trong hệ thống như thế nào.

Bơm nhị phân và bơm bậc bốn đều có ưu điểm và nhược điểm. Nhưng được yêu cầu trộn chính xác các dung môi pha động khác nhau theo cách có thể tái sản xuất. Trộn trực tiếp các dung môi theo tỷ lệ không đổi (cố định) trong toàn bộ quá trình phân tích được gọi là chế độ tách Isocratic. Khi một dung môi được tăng tỷ lệ với dung môi khác trong một khoảng thời gian xác định trước.

Máy bơm nhị phân sử dụng 2 đầu bơm riêng biệt (thực tế là hai máy bơm riêng biệt và độc lập). Và một buồng trộn để cung cấp lưu lượng thể tích dừng nhanh, hiệu quả và thấp trong hệ thống của bạn. Nhưng chỉ có thể cung cấp 2 dung môi cùng một lúc và chúng cũng đắt hơn.

Máy bơm bậc bốn linh hoạt hơn vì chúng có thể vận hành tới 4 dung môi. Theo các tỷ lệ khác nhau trong một gradient nhưng chỉ sử dụng một máy bơm và van định lượng để đạt được điều này. Kết quả có thể là tỷ lệ hỗn hợp kém chính xác hơn một chút so với hệ thống nhị phân.

Một vấn đề nữa cần xem xét trong sắc ký là khả năng các khí hòa tan trong pha động. Chúng có thể tích tụ trong máy bơm, cột hoặc máy dò. Làm tăng các đường cơ sở dao động và áp suất không ổn định.

Bạn có thể làm để loại bỏ khí hòa tan trong pha động, chẳng hạn như:

• Sonication (hiệu quả cao nhưng bất tiện)
• Lọc trong chân không (tương đối hiệu quả, loại bỏ các hạt vật lý nhưng có thể gây ô nhiễm)
• Bộ khử khí trực tuyến (tùy chọn thuận tiện và được sử dụng rộng rãi nhất).

Để bảo vệ hệ thống HPLC và cột của bạn khỏi các hạt vật chất. Nhà sản xuất khuyên bạn nên lọc pha động trước khi sử dụng. Nhiệm vụ này có thể được thực hiện bằng các thiết bị lọc chân không đơn giản. Thêm tất cả các chất đệm và chất điều chỉnh trước khi lọc. Một chân không được áp dụng để kéo dung môi qua bộ lọc. Bộ lọc này cũng có tác dụng khử khí đồng thời pha động. Xử lý các bộ lọc bằng nhíp và đảm bảo bộ máy lọc luôn sạch sẽ.

Nylon 66 là vật liệu lọc tốt cho các pha động chứa nước. Trong khi PTFE là vật liệu lọc tuyệt vời cho hầu hết các dung môi hữu cơ. Màng vô cơ có khả năng chống lại sự phân hủy hóa học từ nhiều loại dung môi HPLC. Xin lưu ý rằng bộ lọc Teflon không thể sử dụng được với nước. Do đặc tính không phân cực của vật liệu.

Yêu cầu lọc pha động HPLC luôn là chủ đề được tranh luận sôi nổi. Nó sẽ loại bỏ các hạt vật lý. Nhưng bạn có nguy cơ làm nhiễm bẩn pha động thông qua các hạt trên bộ lọc. Hoặc bề mặt của dụng cụ thủy tinh được sử dụng. Đồng thời có khả năng làm thay đổi độ pH. Thông qua sự bay hơi của các chất phụ gia điều chỉnh độ pH dễ bay hơi. Ví dụ: axit trifluoroacetic dễ bay hơi và có thể bị mất vào khí quyển trong điều kiện lọc chân không.

Chuẩn bị pha động

Việc chuẩn bị Pha động có thể được chia thành các bước chính sau:

• Đo thể tích thích hợp của từng hóa chất pha động
• Điều chỉnh độ pH của thành phần nước bằng dung dịch đệm
• Thêm bất kỳ chất phụ gia cần thiết nào khác vào thành phần nước của pha động
• Trộn dung môi (nếu cần cho hoạt động đẳng cấp)
• Lọc pha động
• Pha động Degas

Hầu hết các pha động là hỗn hợp của ít nhất hai hóa chất. Thể tích của từng loại phải được đo độc lập. Đồng thời điều chỉnh độ pH và thêm chất phụ gia vào thành phần nước. TRƯỚC KHI kết hợp các dung môi. Điều này tránh được các vấn đề liên quan đến thay đổi thể tích, khi trộn một số dung môi nhất định.

Hỗn hợp 60:40 nước:metanol (v:v) có thể sai tới 10% do ẩn nhiệt khi trộn. Ảnh hưởng đến thể tích tổng thể của dung dịch hỗn hợp. Việc trộn thường được thực hiện trực tiếp bởi hệ thống HPC. Giúp khắc phục các vấn đề khi trộn trước các thành phần pha động. Nhưng đòi hỏi phải sử dụng máy bơm hai hoặc bốn đắt tiền hơn như mô tả ở trên. Khi sử dụng bộ đệm trong phân tích gradient. Hãy đảm bảo rằng chúng hòa tan hoàn toàn trong phạm vi đầy đủ các thành phần pha động dự kiến.

Dung dịch rửa giải HPLC

Độ tinh khiết của dung môi cực kỳ quan trọng. Vì nó có thể ảnh hưởng đến độ nhạy đạt được của phép phân tích. Dung môi kém tinh khiết hơn có thể làm tăng mức nhiễu nền, cũng như tạo ra các đỉnh ma. Nên sử dụng dung môi HPLC của Merck hoặc dung môi tốt hơn. Dung môi cấp độ gradient ít có khả năng tạo ra các đỉnh ma khi sử dụng phương pháp phát hiện tia cực tím. Đối với máy phát hiện MS, đặc biệt nhạy cảm với tạp chất dung môi. Làm thay đổi hằng số điện môi của pha động. Do đó phản ứng của máy dò MS, đặc biệt là khi sử dụng chế độ ion hóa Electrospray cần dùng dung môi ‘MS Grade’.

Những nguyên tắc này cũng cần được áp dụng nghiêm ngặt đối với bất kỳ dung môi Nước. Và thường xảy ra trường hợp chất lượng nước sản xuất nội bộ không được kiểm soát đầy đủ, để duy trì chất lượng của dung dịch rửa giải. Điều này có thể dẫn đến lãng phí thời gian theo dõi nguồn gốc của các đỉnh ma. Và các đợt phân tích mẫu không thành công.

Các nhà sản xuất dung môi thường sẽ cung cấp nhiều loại nước để phân tích HPLC. Nhằm đảm bảo cho người dùng cuối về chất lượng của tất cả các thuốc thử được sử dụng để chuẩn bị pha động.

Cân nhắc về tia cực tím

Khi chọn hóa chất, bạn cũng phải xem xét độ hấp thụ tia cực tím của dung môi. Vì điều này có thể thay đổi từ loại này sang loại khác, tùy thuộc vào bản chất và nồng độ của tạp chất.

Dưới đây là một số ví dụ về giới hạn hấp thụ tia cực tím đối với nhiều loại dung môi HPLC phổ biến:

• Isooctan: 197 nm
• Cyclohexan: 200 nm
• Tetraclometan: 265 nm
• Propan-2-ol: 205 nm
• Ethanol: 210 nm
• Acetonitril: 190 nm
• DMSO: 268 nm
• Metanol: 205 nm

Bằng cách làm việc trên ngưỡng dung môi và thiết lập chính xác các đặc tính thu nhận của máy dò. Người ta có thể tránh được các vấn đề như tăng đường cơ sở trong quá trình phân tích và/hoặc giảm độ nhạy của máy dò.

Ngoài ra, khi sử dụng dung môi cấp thấp hơn, độ hấp thụ tăng từ các tạp chất có trong dung môi hoặc thùng chứa dung môi sẽ dẫn đến hiệu suất phân tích giảm, biểu hiện là độ tái lập của phương pháp bị ảnh hưởng và độ nhạy giảm.

Độ nhớt

Nhìn chung, các dung môi có độ nhớt thấp hơn sẽ cho các pic hẹp hơn do sự chuyển khối lượng của chất phân tích trong pha động được cải thiện. Độ nhớt cũng rất quan trọng khi xem xét áp suất ngược của hệ thống. Dung môi càng nhớt thì áp suất ngược của hệ thống càng cao.

Chỉ số khúc xạ

Máy dò chỉ số khúc xạ hoạt động bằng cách so sánh chỉ số khúc xạ của một tế bào tham chiếu chứa đầy pha động. Với chỉ số khúc xạ của pha động chứa chất phân tích. Sự chênh lệch chiết suất càng lớn thì nồng độ của các loài có mặt tại thời điểm đó càng lớn. Và tín hiệu đầu ra càng lớn. Sẽ đạt được giới hạn phát hiện tốt hơn nếu chiết suất của pha động thay đổi nhiều so với chiết suất của mẫu.

Điểm sôi

Quan trọng trong HPLC chuẩn bị. Dung môi có nhiệt độ sôi thấp sẽ dễ dàng loại bỏ (bằng cách bay hơi) khỏi mẫu.

3.Dung môi và lưu ý cho phân tích sắc ký LC-MS

Dung môi thường được chọn dựa trên độ hòa tan. Và khả năng tương thích của hợp chất được quan tâm với các kỹ thuật ion hóa khác nhau. Được sử dụng trong LC-MS. Tính dễ bay hơi và khả năng cho proton của dung môi rất quan trọng trong ESI và các kỹ thuật ion hóa khí quyển khác.

Các dung môi protic chính như Metanol và hỗn hợp với nước. Chẳng hạn như metanol/nước 1:1 hoặc axetonitril/H ₂ O 1:1, được sử dụng. Mặc dù hỗn hợp nước/metanol làm tăng độ nhớt. Vượt xa cả nước hoặc metanol như một dung môi nguyên chất vì của phản ứng tỏa nhiệt. Áp suất hơi tương đối thấp của nước có thể gây bất lợi cho độ nhạy khi sử dụng ở mức 100%. Kết quả độ nhạy tốt hơn khi sức căng bề mặt giảm đi. Thông qua việc bổ sung dung môi hữu cơ dễ bay hơi. Các chất hoạt động bề mặt có ái lực proton cao hơn. Mặc dù chúng làm tăng sự giải phóng ion khỏi các giọt khí dung, nhưng cũng có thể làm giảm độ nhạy.

Các đồng dung môi không proton như 10% DMSO trong nước và rượu isopropyl. Giúp cải thiện khả năng hòa tan của một số hợp chất. Axit formic thường được thêm vào ở mức thấp (0,1%). Để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình ion hóa. Bằng cách đảm bảo chất phân tích có tính bazơ hơn dung môi. Tuy nhiên, ngay cả với lượng nhỏ, một số axit, như TFA, mặc dù cần thiết cho các hợp chất không hòa tan nhưng có thể hạn chế độ nhạy.

Trong chế độ ion hóa ESI, chất đệm và muối (Na ⁺ , K ⁺ và photphat) làm giảm áp suất hơi và do đó làm giảm tín hiệu. Có thể khắc phục sức căng bề mặt tăng lên của các giọt và giảm độ bay hơi bằng cách sử dụng các chất đệm tương đối dễ bay hơi hơn như amoni axetat, được hình thành bởi cặp axit-bazơ yếu.

Cân nhắc về dung môi trong phân tích LC-MS

• Việc loại bỏ hơi nước và dung môi khỏi vùng ion hóa sẽ làm tăng các loại hợp chất có thể bị ion hóa ở áp suất khí quyển.
• Việc giảm thể tích chất lỏng so với mẫu hoặc chất phân tích quan tâm có trong chất lỏng sẽ cải thiện hiệu suất ESI (tức là tốc độ dòng chảy thấp hơn).
• Dung môi hữu ích
  • Nước
  • Acetonitril
  • Metanol
  • Ethanol
  • Propanol
  • Isopropanol
• Chất bổ sung được chấp nhận
  • Acid acetic
  • Axit formic
  • Ammonium hydroxide
  • Amoni formate (nồng độ muối = 10 mM hoặc ít hơn)
  • Amoni axetat (nồng độ muối = 10 mM trở xuống)
• Các muối không bay hơi (photphat, borat, citrat, v.v.)
  • Có thể đọng lại trong nguồn và các mao mạch bịt kín. Do đó cần nhiều hoạt động vệ sinh và bảo trì hơn
  • Các thiết kế nguồn hiện đại có thể xử lý các chất không biến đổi tốt hơn các thiết kế cũ
• Các chất hoạt động bề mặt (chất hoạt động bề mặt/chất tẩy rửa) ngăn chặn quá trình ion hóa phun điện
• Axit vô cơ có tính ăn mòn
• Axit trifloaxetic (TFA)
  • Ở một mức độ nào đó ngăn chặn quá trình phun điện ion dương ở mức vượt quá 0,01%.
  • Máy phun điện tử ion âm bị ức chế rất nhiều.
• Trietylamin (TEA)
  • PA cao (232 Kcal/mol) tạo ra ion [M+H]+ cường độ cao ở  m/z  102
  • Ngăn chặn sự phun điện ion dương của các hợp chất kém cơ bản hơn.
• Tetrahydrofuran (THF)
  • 100% THF rất dễ cháy nên APCI và hầu hết các kỹ thuật giao tiếp đều sử dụng nitơ làm khí phun sương. (Sử dụng không khí sẽ tạo ra nguy cơ nổ).
  • Phản ứng với ống PEEK.

Ức chế ion và lựa chọn hóa chất

Sự ức chế ion là một trong những vấn đề dễ thấy hơn mà các nhà quang phổ phải đối mặt khi sử dụng ESI (Khối phổ ion hóa phun tĩnh điện) làm kỹ thuật ion hóa. Ấn phẩm của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA),  Hướng dẫn Công nghiệp về Xác nhận Phương pháp Phân tích Sinh học (Federal. Register , 66, 100, 28526) năm 2001 đề cập lưu ý một số quy trình thử nghiệm để đánh giá sự hiện diện của  sự ức chế ion.

Người ta so sánh phản  ứng theo dõi nhiều phản ứng (MRM) (diện tích cực đại hoặc chiều cao cực đại) của chất phân tích trong mẫu sau chiết đã thêm chuẩn. Với mẫu của chất phân tích được bơm trực tiếp vào pha động nguyên chất. Tín hiệu chất phân tích thấp ở nền so với dung môi nguyên chất  cho thấy sự có mặt của  các thực thể gây nhiễu.

Một ấn phẩm của C. Mallet  et al . mô tả vị trí hiện diện  của ma trận sắc ký đồ đối với chất phân tích (và  chất chuẩn nội). Các nhà thí nghiệm sử dụng  dòng chảy liên tục của dung dịch chuẩn chứa chất phân tích quan tâm. Và chất chuẩn nội của nó được thêm vào dòng thải của cột. Sau khi bơm  dịch chiết mẫu trắng vào hệ thống LC. Sự sụt giảm trong  đường cơ sở không đổi cho thấy sự ức chế  ion hóa của chất phân tích do sự có mặt  của vật liệu gây nhiễu.

Cột sắc ký

Một sự thay đổi có thể thực hiện được trong công nghệ là sự ra đời của các cột hóa học lai và các hạt có tính chọn lọc cao có đường kính dưới 2 micromet. Các hóa chất lai ít phụ thuộc hơn vào các chất điều chỉnh pha động vì có thể gây ra sự ức chế ion và tăng tính chọn lọc của các hạt.

4. Dung môi hiệu suất cao cho phân tích HPLC và LC-MS của Merck

Sử dụng hóa chất LiChrosolv® – Merck có độ tinh khiết và độ nhạy cao sẽ giúp kết quả sắc ký của bạn đáng tinh cậy hơn. Chúng có độ truyền tia cực tím cao, số lượng hạt thấp, độ axit và độ kiềm thấp và mức dư lượng bay hơi thấp. Đây là dung môi lý tưởng cho việc phân tích. Tất cả các sản phẩm LiChrosolv® đều được lọc vi mô ở mức 0,2 µm.

LiChrosolv® ở cấp gradient cho phép bạn giảm thiểu hiệu ứng gradient của dung môi liên quan – ví dụ như trong quá trình phân tách đối quang trên các pha bất đối – và phù hợp với UPLC và UHPLC.

Để thực hiện phân tích LC-MS, Merck cung cấp LiChrosolv® hypergrade. Một nhóm dung môi được tối ưu hóa và kiểm tra đặc biệt về tính phù hợp với LC-MS. Đáp ứng mọi yêu cầu của phương pháp ion hóa LC-MS hiện đại (ESI/APCI – chế độ dương và âm). Do mức độ nền ion thấp và khả năng ức chế ion thấp. LiChrosolv® hypergrade đảm bảo độ tái lập cao và hiệu quả ion hóa cao.

Bảng giá hóa chất Merck 2023:

Tên sản phẩm	Mã sản phẩm	Quy cách	Đơn giá (VNĐ)
1-Butanol for liquid chromatography	1019881000	1 L	4,457,400
1-Butanol for liquid chromatography	1019882500	2.5 L	11,867,300
1-Chlorobutane for liquid chromatography	1016921000	1 L	3,336,100
1-Methyl-2-pyrrolidone for liquid chromatography	5438991000	1 L	2,689,800
1-Methyl-2-pyrrolidone for liquid chromatography	438992500	2.5 L	6,489,300
1-Propanol for liquid chromatography	1010241000	1 L	2,696,300
1-Propanol for liquid chromatography	1010242500	2.5 L	5,567,100
1,4-Dioxane for liquid chromatography	1031321000	1 L	4,963,600
1,4-Dioxane for liquid chromatography	1031322500	2.5 L	10,802,300
2-Propanol hypergrade for LC-MS	1027811000	1 L	1,188,900
2-Propanol hypergrade for LC-MS	1027812500	2.5 L	2,404,700
Acetone for liquid chromatography	1000201000	1 L	897,000
Acetone for liquid chromatography	1000202500	2.5 L	1,296,200
Acetonitrile gradient grade for liquid chromatography	1000301000	1 L	2,559,900
Acetonitrile gradient grade for liquid chromatography	1000302500	2.5 L	1,532,700
Acetonitrile hypergrade for LC-MS	1000291000	1 L	1,359,900
Acetonitrile hypergrade for LC-MS	1000292500	2.5 L	2,537,000
Acetonitrile with 0.05% (v:v) Trifluoroacetic acid	4806722500	2.5 L	7,718,400
Chloroform for liquid chromatography	1024441000	1 L	1,201,300
Chloroform for liquid chromatography	1024442500	2.5 L	5,013,900
Cyclohexane for liquid chromatography	1028271000	1 L	2,601,100
Cyclohexane for liquid chromatography	1028272500	2.5 L	5,377,400
Dichloromethane for liquid chromatography	1060441000	1 L	1,763,100
Dichloromethane for liquid chromatography	1060442500	2.5 L	3,329,500
Ethanol gradient grade for liquid chromatography	1117270500	500 ml	1,310,900
Ethanol gradient grade for liquid chromatography	1117271000	1 L	1,296,200
Ethyl acetate for liquid chromatography	1008681000	1 L	1,180,800
Ethyl acetate for liquid chromatography	1008682500	2.5 L	3,295,600
Ethyl acetate hypergrade for LC-MS	1036491000	1 L	1,121,900
Ethyl acetate hypergrade for LC-MS	1036492500	2.5 L	2,347,000
Isohexane for liquid chromatography	1043352500	2.5 L	6,117,300
Methanol for liquid chromatography	1060181000	1 L	473,600
Methanol for liquid chromatography	1060182500	2.5 L	589,500
Methanol hypergrade for LC-MS	1060351000	1 L	971,000
Methanol hypergrade for LC-MS	1060352500	2.5 L	2,013,700
Toluene for liquid chromatography	1083271000	1 L	1,699,600
Toluene for liquid chromatography	1083272500	2.5 L	4,342,100
Water for UHPLC-MS	1037281002	1 L	2,496,700
Water for chromatography (LC-MS Grade)	1153331000	1 L	700,600
Water for chromatography (LC-MS Grade)	1153332500	2.5 L	502,200
n-Hexane for liquid chromatography	1043911000	1 L	1,521,300
n-Hexane for liquid chromatography	1043912500	2.5 L	2,529,700

5. Dung môi cho phương pháp UV-VIS

6. Dung môi cho phương pháp Sắc ký khí (GC)

7. Dung môi cho phương pháp AAS/ICP

8. Kết luận

Sắc ký lớp mỏng (TLC) là kỹ thuật phổ biến trong phân tích. Trong bài viết này chúng tôi sẽ cung cấp thông tin để chọn tấm TLC phù hợp.

1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng

1.1 Phân loại

Sắc ký lớp mỏng là kỹ thuật phân tách các chất từ một chất khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh. Pha tĩnh được trải một lớp mỏng đồng nhất và được cố định ở các phiến kính hoặc một phiến kim loại.Pha động là hệ dung môi đơn lẻ hoặc đa thành phần được hòa trộn với nhau theo tỷ lệ qui định sẵn. Di chuyển trên một bản mỏng theo lực mao quản. Các phân tử trong hỗn hợp mẫu thử sẽ được di chuyển trên lớp mỏng. Qua lớp hấp phụ, , theo hướng của pha động với tốc độ khác nhau. Kết quả sẽ thu được một dải ảnh được gọi là sắc ký đồ.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer Chromatography: HPTLC) là một dạng sắc ký lớp mỏng tiên tiến nhất. Phương pháp này xuất phát từ việc sử dụng pha tĩnh phân tách tối đa và các thiết bị đo đạc hiện đại trong trong qui trình phân tích. Yêu cầu của sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao cần chấm mẫu chính xác, vết chấm phải nằm trên bề mặt. Chuẩn hóa sắc ký có đạt được độ tái lặp cao và kết quả được đánh giá bằng phần mềm.

Sắc ký ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: dược phẩm, thực phẩm, đồ uống, hóa chất, môi trường,.. Một số phương pháp sắc ký khác được sử dụng trong phòng thí nghiệm như: Sắc ký cột, Sắc ký giấy, Sắc ký khí, Sắc ký lỏng,…

1.2 Cơ chế sắc ký lớp mỏng

Nguyên tắc sắc ký lớp mỏng giống như tất cả các  phương pháp sắc ký khác: mỗi hợp chất sẽ có ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh (lớp silica gel hoặc alumina mỏng đồng nhất, phủ lên một mảnh thủy tinh, kim loại hoặc nhựa cứng). Pha động (chất lỏng hoặc chất khí). Pha động chảy qua pha tĩnh và mang theo các thành phần của hỗn hợp. Các thành phần khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau. Điều này tạo ra kết quả thu được của sắc ký lớp mỏng là các điểm màu phát quang phân tách rõ ràng.

Retention factor (Rf) – hệ số lưu giữ

Sau khi quá trình phân tách hoàn tất, các hợp chất riêng lẻ được xuất hiện dưới dạng các điểm và phân tách theo chiều dọc. Mỗi điểm có một hệ số lưu giữ (Rf) được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng dịch chuyển của chất thử và khoảng dịch chuyển của dung môi:

Công thức tính hệ số Rf là: Rf= Quãng đường mẫu đi được / Quãng đường dung môi đi được tính từ điểm chấm mẫu

Khi so sánh hai hợp chất khác nhau trong cùng điều kiện, hợp chất nào có khối lượng lớn hơn giá trị Rf sẽ ít phân cực hơn vì nó không bám vào pha tĩnh lâu như hợp chất phân cực.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến hệ số Rf như độ dày, độ ẩm trên bản TLC, độ bão hòa của bình, nhiệt độ, bản chất của bản TLC, cỡ mẫu và các thông số dung môi.

1.3 Thiết bị và dụng cụ thực hiện Sắc ký lớp mỏng

1.3.1 Tấm (Pha tĩnh)

Như đã đề cập trước đó, các bản TLC (hay còn được gọi là bản sắc ký) có thể được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm. Nhưng thường sẽ được chọn mua là nhiều nhất. Pha tĩnh phổ biến nhất là Silica gel và alumina, nhưng những loại khác cũng có sẵn.

Nhiều tấm kết hợp với một hợp chất phát huỳnh quang dưới tia cực tím bước sóng ngắn (254 nm). Mặt sau của các tấm TLC thường là thủy tinh, nhôm hoặc nhựa. Tấm kính cứng, trong suốt và có thể tái sử dụng có khả năng kháng hóa chất cao và ổn định nhiệt tốt khi đốt than. Vì những lý do này, chúng là tấm đỡ được sử dụng rộng rãi nhất.

Tấm lá nhôm là giải pháp thay thế hỗ trợ giúp dễ dàng xử lý và chống vỡ. Nhẹ và mỏng hơn tấm kính, tấm nhôm có thể giảm chi phí vận chuyển và tiết kiệm không gian lưu trữ. Ngoài ra, chúng có thể dễ dàng cắt bằng kéo theo kích thước mong muốn và dễ lưu trữ trong phòng thí nghiệm.

Các tấm đỡ bằng nhựa hoặc polyester (PET) cũng được sử dụng vì nhẹ và linh hoạt.

Làm cách nào để chọn các tấm TLC phù hợp?

Bảng so sách bên dưới sẽ cung cấp các thông tin ưu và nhược điểm của các tấm TLC:

Tấm	Ưu điểm	Nhược điểm
Thủy tinh	Cứng rắn Trong suốt Tiết kiệm chi phí (có thể tái sử dụng) Kháng hóa chất cao Được sử dụng phổ biến nhất Ổn định nhiệt độ	Dễ vỡ Không thể dễ dàng cắt theo kích thước mong muốn Nặng – chi phí vận chuyển cao Dày (>1,0 mm) – cần không gian kệ rộng hơn khoảng 5 lần so với các tấm có mặt sau bằng nhôm hoặc nhựa Mặt sau rất dễ bị vỡ (vấn đề an toàn tiềm ẩn)
Giấy nhôm	Dễ dàng xử lý/an toàn – chống vỡ Có thể dễ dàng cắt theo kích thước mong muốn bằng kéo Mỏng (~0,15 mm) – tiết kiệm không gian lưu trữ Nhẹ – chi phí vận chuyển thấp hơn Kháng dung môi Độ bám dính của lớp hấp phụ mạnh – tốt để sử dụng với chất rửa giải có chứa nồng độ cao Ổn định nhiệt tốt Có thể lưu vào sổ tay phòng thí nghiệm	Không thể tái sử dụng Không kháng hóa chất như thủy tinh đối với thuốc thử như axit vô cơ và amoniac đậm đặc
Nhựa (Polyester – PET)	Dễ dàng xử lý/an toàn – chống vỡ Có thể dễ dàng cắt theo kích thước mong muốn bằng kéo Mỏng (~0,2 mm) – tiết kiệm không gian lưu trữ Nhẹ – chi phí vận chuyển thấp hơn Kháng dung môi Có thể lưu vào sổ tay phòng thí nghiệm	Không thể tái sử dụng Độ ổn định nhiệt thấp hơn – phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn so với thủy tinh Lớp hấp phụ có thể dễ bị nứt hơn

Các tấm TLC có pha tĩnh như:

• Silica gel – chất hấp thụ phổ biến nhất. Dung dịch rửa giải được sử dụng như sử dụng cho HPLC. Không có chất xúc tác của alumina. Sản phẩm thông dụng như TLC Silica gel 60 F₂₅₄
• Oxit nhôm – chất hấp thụ TLC phổ biến thứ hai.
• Cellulose – có sẵn ở dạng cellulose vi tinh thể hoặc sợi. Lớp xenlulô vi tinh thể có các vết nhỏ hơn so với lớp xenlulô dạng sợi.
• Polyamide – độ khuếch tán thấp, cho phép các điểm mẫu giới hạn với cường độ tối đa.

Pha tĩnh	Cơ chế sắc ký	Ứng dụng tiêu biểu
Gel silica	Hấp phụ	steroid, axit amin, rượu, hydrocacbon, lipid, aflaxtoxin, mật, axit, vitamin, alkaloid
Silica gel RP	Pha ngược	axit béo, vitamin, steroid, hormone, caroten
Cellulose, kieselguhr	Vách ngăn	cacbohydrat, đường, rượu, axit amin, axit cacboxylic, axit béo
Oxit nhôm	Hấp phụ	amin, rượu, steroid, lipid, aflatoxin, axit mật, vitamin, alkaloid
Xenlulô PEI	Trao đổi ion	axit nucleic, nucleotide, nucleoside, purin, pyrimidine
Magiê silicat	Hấp phụ	steroid, thuốc trừ sâu, lipid, alkaloid

Tùy theo đặc tính của mẫu mà chúng ta chọn pha tĩnh phù hợp. Chúng tôi cung cấp nhiều lựa chọn các tấm TLC phân tích tiêu chuẩn.

HPTLC mang lại những lợi thế khác biệt hơn TLC. Như khả năng phân giải tốt hơn, thời gian phân tách nhanh, khuếch tán mẫu thấp hơn. Và giảm mức tiêu thụ dung môi. Các bản HPTLC có sẵn được phủ nhiều loại chất nền khác nhau và có hoặc không có chất chỉ thị. Bản sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) đặc trưng bởi các hạt nhỏ hơn 10 µm, các lớp mỏng nhỏ hơn 200 µm.

1.3.2 Chất kết dính

Chất kết dính không ảnh hưởng đến các đặc tính hấp phụ của ma trận. Nhưng chúng ảnh hưởng đến sự kết dính của lớp chất hấp phụ với lớp nền. Chất kết dính sẽ gồm:

• Chất kết dính polyme (hữu cơ) – có các lớp hấp phụ chứa chất kết dính polyme thường chắc chắn nhất. Giúp cho việc xử lý và ứng dụng phân tích mẫu dễ dàng hơn. Chúng cũng cho phép sử dụng hàm lượng nước cao hơn trong dung môi sử dụng. Chúng thường được khuyến nghị cho tất cả các ứng dụng TLC ngoại trừ những ứng dụng sử dụng tính năng tạo than để trực quan hóa.
• Chất kết dính vô cơ: Tấm có các lớp hấp phụ chứa chất kết dính vô cơ không chắc chắn như tấm có chất kết dính hữu cơ. Nhưng nhìn chung chắc chắn hơn tấm không có chất kết dính hoặc có chất kết dính thạch cao. Chúng có khả năng chống nước cao nhất và tương thích với các thuốc thử dạng nước. Chất kết dính vô cơ thường được sử dụng cho các bản TLC chuẩn vì chúng mềm. Cho phép dễ dàng bỏ các điểm chứa phân tử mục tiêu khỏi chất hỗ trợ rửa giải và phục hồi.
• Thạch cao – tấm sử dụng chất kết dính thạch cao thường ít chắc chắn nhất và dễ gãy. Chúng không được khuyến cáo sử dụng với dung môi chứa hơn 20% nước. Giống như các tấm có các lớp vô cơ, chúng cho phép dễ dàng loại bỏ các điểm chứa phân tử mục tiêu khỏi chất hỗ trợ cho quá trình rửa giải và thu hồi. Được khuyên dùng cho các ứng dụng yêu cầu hóa than để hiển thị.

  1.3.3 Dung môi (Pha động)

Lựa chọn dung môi thích hợp có lẽ là khía cạnh quan trọng nhất của sắc ký lớp mỏng. Một dung môi phổ biến là 1:1 hexan:etyl axetat. Việc thay đổi tỷ lệ có thể có tác động rõ rệt đến giá trị Rf nằm trong khoảng từ 0 đến 1. Với 0 biểu thị độ phân cực của dung môi rất thấp. Và 1 biểu thị độ phân cực của dung môi rất cao.

Khi thực hiện thử nghiệm sắc ký lớp mỏng, bạn không muốn các giá trị của mình là 0 hoặc 1. Vì các thành phần mà bạn đang tách có các cực khác nhau. Nếu giá trị bằng 0, bạn cần tăng độ phân cực của dung môi. Vì mẫu không chuyển động và dính vào pha tĩnh. Nếu giá trị là 1, bạn cần giảm độ phân cực của dung môi vì hợp chất không thể tách rời.

Nếu bạn biết rằng một thành phần của hỗn hợp không hòa tan trong một dung môi nhất định. Nhưng một thành phần khác hòa tan tự do trong đó, thì nó thường cho phép phân tách tốt. Tốc độ các hợp chất di chuyển lên tấm phụ thuộc vào hai điều:

• Nếu hợp chất hòa tan trong dung môi, nó sẽ di chuyển xa hơn lên tấm sắc ký lớp mỏng
• Nếu hợp chất thích pha tĩnh, nó sẽ dính vào nó, điều này sẽ khiến nó không di chuyển xa trên sắc ký đồ.

Axit, bazơ và các hợp chất phân cực mạnh:

Thường tạo ra các vệt rõ hơn là các vết trong dung môi trung tính. Các vệt gây khó khăn cho việc tính (Rf) và thậm chí nó còn che lấp các điểm khác. Thêm một vài phần trăm axit axetic hoặc axit formic vào dung môi. Có thể khắc phục hiện tượng sọc bằng axit. Nước hiếm khi được sử dụng làm dung môi vì nó tạo ra mặt trước đường cong không đồng đều. Nguyên nhân là do sức căng bề mặt của nó.

Tương tự như vậy đối với bazơ, thêm một vài phần trăm triethylamine có thể cải thiện kết quả. Đối với các hợp chất phân cực, thêm một vài phần trăm metanol cũng có thể cải thiện kết quả.

Độ bay hơi của dung môi cũng cần được xem xét khi sử dụng. Bất kỳ dung môi nào còn lại trên đĩa cũng có thể gây ra các phản ứng . Nhiều dung môi có thể được loại bỏ bằng cách để yên trong vài phút, nhưng những dung môi rất khó bay hơi có thể cần thời gian trong buồng chân không. Dung môi dễ bay hơi chỉ nên được sử dụng một lần. Nếu pha động được sử dụng nhiều lần, kết quả sẽ không nhất quán hoặc không thể lặp lại. Hỗn hợp dung môi hữu ích:

• Dung môi có thể dùng để tách hỗn hợp các hợp chất phân cực mạnh là etyl axetat : butanol : axit axetic : nước, 80:10:5:5.
• Để tách các thành phần bazơ mạnh, tạo hỗn hợp 10% NH ₄ OH trong metanol, sau đó tạo hỗn hợp 1 đến 10% này trong dichlormethane.
• Hỗn hợp 10% metanol hoặc ít hơn trong DCM có thể hữu ích để tách các hợp chất phân cực.

1.3.4 Pipet

Các điểm được chấm lên tấm TLC bằng cách sử dụng pipet thủy tinh rất mỏng. Mao quản phải đủ mỏng để thực một điểm gọn gàng. Nhưng không quá mỏng để ngăn cản sự hấp thu đủ lượng chất phân tích.

1.3.5 Bình chạy sắc ký lớp mỏng

Chuẩn bị bình chạy sắc ký: Các bình thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ. Có nắp đậy kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa hơi dung môi vào khí quyển trong bình. Bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình. Lắc rồi để giấy lọc thấm đều dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc. Còn lại một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Đậy kín nắp bình và để yên 1 h ở nhiệt độ 20 °C đến 25 °C.

Muốn thu được những kết quả lặp lại, ta chỉ nên dùng những dung môi thật tinh khiết. Loại dùng cho sắc ký. Những dung môi dễ bị biến đổi về hóa học chỉ nên pha trước khi dùng. Nếu sử dụng những hệ pha động phức tạp, phải chú ý đến những thành phần dễ bay hơi. Sẽ làm thay đổi thành phần của hệ pha động dẫn đến hiện tượng không lặp lại của trị sốRf.

1.3.6 Các dụng cụ khác

• Đèn tử ngoại, phát các bức xạ có bước sóng ngắn 254 nm và bước sóng dài 365 nm.
• Dụng cụ để phun thuốc thử.
• Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hóa và sấy bản mỏng và sắc ký đồ, hoặc để sấy nóng đối với một số phản ứng phát hiện.
• Tủ hút hơi độc.
• Máy sấy dùng để sấy khô sắc ký đồ và cho phép chấm nhanh nhiều lần những dung dịch pha loãng chất cần phân tích.
• Một máy ảnh tốt có thể chụp lưu giữ sắc ký đồ ở ánh sáng ban ngày với khoảng cách 30 cm đến 50 cm.
• Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng.
• Micropipet nhiều cỡ từ 1 μl, 2 μl, 5 μl, 10 μl đến 20 μl, các ống mao quản hoặc dụng cụ thích hợp.
• Thiết bị trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng đều, có chiều dày thích hợp.
• Giá để xếp các tấm kính đã trải.

1.4 Triển khai sắc ký lớp mỏng

Tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng theo các bước cơ bản sau:

1. Cắt tấm TLC theo đúng kích thước và dùng bút chì (không bao giờ dùng bút mực), nhẹ nhàng vẽ một đường thẳng trên đĩa cách đáy khoảng 1 cm. Không sử dụng lực quá mạnh khi viết trên tấm TLC vì điều này sẽ loại bỏ pha tĩnh. Điều quan trọng là sử dụng bút chì thay vì bút mực vì mực thường di chuyển lên đĩa cùng với dung môi.
2. Sử dụng pipet, bôi các điểm chất phân tích lên vạch. Đảm bảo có đủ mẫu trên đĩa. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng tia cực tím sóng ngắn. Một điểm màu tím nên được nhìn thấy. Nếu vết không nhìn thấy được, cần thêm nhiều mẫu hơn vào đĩa. Nếu có sẵn chất chuẩn của hợp chất mục tiêu, thì nên tạo ra một vết đồng màu bằng cách chấm chất chuẩn lên một vết của hỗn hợp chưa biết.
3. Đặt đĩa vào trong buồng càng đều càng tốt và tựa nó vào một bên. Không bao giờ cho phép dung môi lớn vượt quá vạch bạn đã vẽ. Cho phép hoạt động mao dẫn hút dung môi lên trên tấm cho đến khi nó cách điểm cuối khoảng 1 cm. Không bao giờ để dung môi di chuyển hết đến cuối đĩa.
4. Lấy đĩa ra và ngay lập tức vẽ một đường bút chì trên mặt dung môi.
5. Sử dụng đèn UV bước sóng ngắn và khoanh tròn các thành phần được hiển thị bằng bút chì.

1.5 Phát hiện

Khi quá trình triển khai sắc ký lớp mỏng hoàn tất, cần phải có hình ảnh trực quan của các vết trên sắc ký đồ để phát hiện và đánh giá kết quả. Nhiều hợp chất có hấp thụ ánh sáng UV hoặc có đặc tính huỳnh quang khi bị kích thích bởi tia cực tím hoặc ánh sáng nhìn thấy thì có thể phát hiện trực tiếp. Nhưng hầu hết các hợp chất không có màu rõ ràng nên phải sử dụng thuốc thử thích hợp để hiện màu. Số lượng thuốc thử phát hiện khi phân tích bằng Sắc ký lớp mỏng rất lớn điều đó phản ánh tính linh hoạt của kỹ thuật phát hiện.

Iodine (Iốt)  là một trong những thuốc thử phổ biến nhất. Hầu hết các hợp chất hữu cơ sẽ bị nhuộm màu nâu tạm thời. Một số thuốc thử được sử dụng như là Permanganat, ceric ammonium molybdate (CAM) và p-anisaldehyde.

3. Ưu điểm và nhược điểm của Sắc ký lớp mỏng và Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

3.1 Ưu điểm

Sắc ký lớp mỏng và Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được ứng dụng rộng rãi trong phân tích. Cho nhiều đối tượng thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau. Ưu điểm của chúng là:

• Bản mỏng hiện có sẵn trên thị trường nên dễ dàng triển khai phân tích
• Có thể thực hiện điều chế và thu được chất tinh khiết nhanh chóng, đơn giản
• Thời gian phân tích thấp hơn và chi phí cho mỗi mẫu phân tích ít hơn
• Các bước chuẩn bị mẫu đơn giản – ít gặp vấn đề về nền mẫ. Không cần trình độ cao đối với người phân tích
• Phân tích đồng thời các mẫu thử và chuẩn – độ chính xác, hiếm khi cần chuẩn nội
• Không cần xử lý trước đối với dung môi như lọc và khử khí
• Tiêu thụ dung môi ở pha động ít cho mỗi mẫu nên thân thiện với môi trường
• Không chịu sự ảnh hưởng từ lần phân tích trước. Pha tĩnh và pha động luôn mới cho mỗi lần phân tích, không có nhiễm chéo
• Có thể phát hiện với nhiều chế độ khác nhau đặc hiệu cho mỗi nhóm chất
•  Tài liệu hóa dễ dàng
• Chi phí bảo trì thấp

3.2 Nhược điểm

Bên cạnh đó phương pháp Sắc ký lớp mỏng cũng có những nhược điểm như:

• Độ tái lập có thể không đạt được nếu điều kiện độ ẩm không được kiểm soát tốt
• Do hệ thiết bị Sắc ký lớp mỏng đơn giản nên đa số chỉ có thể định tính chứ không thể định lượng được
• Yêu cầu có chất chuẩn để làm chuẩn
• Độ nhạy bị ảnh hưởng do lượng mẫu thực hiện phân tích nhỏ.

4. Ứng dụng sắc ký lớp mỏng trong kiểm nghiệm thuốc

Sắc ký lớp mỏng cùng với sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là hai phương pháp được áp dụng nhiều trong phân tích của ngành dược phẩm, hóa học lâm sàng, hóa học pháp y, hóa sinh. Một số ngành khác như mỹ phẩm, phân tích thực phẩm, phân tích môi trường.

Trong kiểm nghiệm thuốc Sắc ký lớp mỏng được sử để theo dõi quá trình phản ứng của tổng hợp thuốc. Định tính và xác định độ tinh khiết của nguyên liệu, thành phẩm thuốc. HPTLC với hệ thống trang thiết bị đồng bộ, độ chính xác cao cho phép định tính và cả định lượng để tiêu chuẩn hóa thuốc nguyên liệu và thành phẩm.

4.1 Định tính

Nguyên liệu và các thành phẩm thuốc có nền mẫu tương đối đơn giản. Hơn nữa qui trình phân tích bằng sắc ký lớp mỏng trong Dược điển đã ổn định. Do đó TLC được sử dụng trong hầu hết các phép thử định tính của đối tượng này. Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao rất ít khi được dùng để định tính thành phẩm thuốc hóa dược. Nguyên tắc định tính bằng sắc ký lớp mỏng, mẫu thử được thực hiện song song với mẫu chuẩn và so sánh khoảng cách (R) chúng di chuyển với khoảng cách của chất đối chiếu đã biết. Màu sắc vết trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử phải được thực hiện song song, nếu trùng nhau thì được coi là dương tính.

Đối với phép sắc ký thực hiện trên hệ thống Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có bộ phận quét phổ (scanner), còn có thể tiến hành quét phổ hấp thụ UV – Vis tại vị trí vết chất phân tích trên sắc ký đồ để định tính. Khi định tính bằng HPLC – DAD, bộ phận scanner vừa có khả năng quét phổ trong vùng UV – Vis, đồng thời có thể thực hiện chồng phổ của vết chất phân tích.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao có ưu điểm hơn với sắc ký lớp mỏng là có thể tách riêng chất phân tích ra khỏi các chất khác trong hỗn hợp với độ chọn lọc cao. Do đó một số dược điển như USP yêu cầu định tính sử dụng bản mỏng HPTLC.

4.2 Xác định tạp chất

Định danh tạp chất đã biết được xác định dựa vào so sánh với Rf của vết tạp chuẩn làm trên cùng bản mỏng. Khi đánh giá kết quả thường là phép thử giới hạn cũng có thể là định lượng. Đánh giá kết quả căn cứ vào đậm độ về màu sắc của vết chất phân tích tách ra trên sắc đồ. Đối với sắc ký lớp mỏng cường độ vết được phát hiện bằng mắt. Còn trong sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, vết chất phân tích được chuyển thành dạng pic với thông số diện tích hoặc chiều cao pic tương tự HPLC. Sắc ký đồ chuyển từ dạng vết sang dạng pic trong sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được gọi là sắc ký đồ dạng pic hay sắc ký đồ analog.

Để xác định giới hạn tạp chất bằng sắc ký lớp mỏng thường thực hiện theo 2 cách như sau:

Pha loãng dung dịch thử

Yêu cầu phép phân tích là phải phát hiện được vết trong sắc ký đồ. Do đó, thường so sánh cường độ vết thu được của dung dịch mẫu thử với dung dịch pha loãng của chất kiểm tra. Mẫu thử được chuẩn bị ở mức nồng độ cao, mẫu đối chiếu sẽ được pha loãng với mẫu thử đến mức giới hạn (mẫu đối chiếu cũng có thể mẫu pha từ chất chuẩn ở mức nồng độ giới hạn). Mẫu thử được phân tích ở nồng độ cao nhằm phát hiện tất cả các tạp. Mẫu đối chiếu ở nồng độ thấp nhằm đảm bảo độ tuyển tính của hoạt chất. Đáp ứng của hoạt chất có trong mẫu có nồng độ thấp tương tự tạp chất liên quan có nồng độ cao.

Một số thuốc thử tạo dẫn xuất trong phân tích dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng :

Sử dụng chất chuẩn

Nồng độ các tạp chất được xác định dựa trên cường độ vết của tạp trong mẫu thử  và đáp ứng của chuẩn tạp tương ứng. Thông thường, nồng độ dung dịch chuẩn tạp được chuẩn bị ở mức giới hạn cho phép của tạp đó. Khi tiến hành xác định tạp chất, cần chú ý đến độ nhạy của phương pháp và khả năng tách của hệ thống.

Sắc ký lớp mỏng thường chỉ được ứng dụng trong định tính, hầu như không được sử dụng trong định lượng nói chung và đối tượng thuốc nói riêng.

Còn Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với những cải tiến nhằm tăng độ phân giải của quá trình tách, đảm bảo độ tái lặp cũng như độ đúng của phép thử cho phép ứng dụng rộng rãi trong phân tích định lượng các chất. Việc sử dụng các thiết bị hiện đại như: máy quét, máy đo mật độ vết. Điều kiện buồng sắc ký được kiểm soát, chất hấp phụ đa dạng về chủng loại có độ phân giải cao. Kích thước hạt nhỏ và đồng đều, khả năng kết nối với các thiết bị phát hiện khác nhau. Cùng với sự phát triển của các chương trình phần mềm để thu và xử lý số liệu giúp cho sắc ký lớp mỏng trở thành một phương pháp thay thế HPLC hoặc sắc ký khí.

Việc sử dụng Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao được đánh giá cao và được chấp nhận trên toàn thế giới. Ngày càng có nhiều công bố các nghiên cứu sử dụng HPTLC trong định lượng thuốc đã được đăng tải. Bao gồm kiểm tra chất lượng trong quá trình sản xuất, theo dõi độ ổn định, thậm chí trong lâm sàng.

5. Kết luận

Sắc ký lớp mỏng là phương pháp đơn giản, nhanh chóng, tiết kiệm chi phí và hiệu quả. Do đó được ứng dụng rộng rãi phân tích nhiều loại đối tượng mẫu khác nhau. Qua thời gian, nó đã chứng minh được độ tin cậy của kết quả thử nghiệm và được công nhận là phương pháp thường qui để định tính, thử tinh khiết trong kiểm nghiệm thuốc hóa dược, dược liệu.

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao là một dạng sắc ký lớp mỏng tiên tiến nhất với việc sử dụng pha tĩnh có hiệu quả phân tách tối đa. Thiết bị đo đạc hiện đại cho tất cả các bước trong qui trình phân tích. Cho phép giải quyết tất cả các yêu cầu phân tích bao gồm định tính, thử tinh khiết và định lượng phù hợp với các chuẩn mực qui định về phương pháp phân tích như ICH, AOAC.

Tài liệu tham khảo

1. Touchstone, Joseph C. Practice of thin layer chromatography. 2nd ed. New York: Wiley, 1983.Print.
2. Geiss, Friedrich. Fundamentals of thin layer chromatography planar chromatography. Heidelberg: A. Hüthig, 1987. Print.
3. Touchstone, Joseph C. Practice of thin layer chromatography. 3rd ed. New York: Wiley, 1992. Print.
4. Figures: “Thin layer chromatography -.” Wikipedia, the free encyclopedia. Web. 03 Dec. 2009. <http://en.wikipedia.org/wiki/Thin_la…chromatography>.

Sắc ký là phương pháp được dùng để phân tách các thành phần cần tách giữa hai pha, là pha tĩnh và pha động. Thành phần của hỗn hợp sẽ tự phân chia lại giữa hai pha bằng một quá trình như hấp phụ, phân vùng, trao đổi ion hoặc loại trừ kích thước.

1. Phương pháp và kỹ thuật sắc ký

Sắc ký được được chia làm 2 loại là:

Sắc ký điều chế (preparative chromatography) được dùng để phân tách một lượng nhỏ các đơn chất. Thường từ 10 – 1000 mg) từ một hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử).

1.1 Kỹ thuật sắc ký dạng luống

1.2. Kỹ thuật sắc ký phẳng

2.Cách chọn sắc ký lớp mỏng phù hợp là gì?

Các tấm TLC silica được sử dụng trong nhiều lĩnh vực như:

• Kiểm soát quá trình tổng hợp thuốc
• Kiểm tra độ nhận dạng và độ ổn định của thuốc
• Phân tích dư lượng trong các mẫu thực phẩm và môi trường
• Kiểm soát chất lượng dược phẩm, thực phẩm và các hợp chất môi trường

Để biết thêm thông tin ưu nhược điểm của các loại bản TLC silica, bạn tham khảo thêm tại đây – Cách chọn săc ký lớp mỏng phù hợp.

1.3. Kỹ thuật sắc ký theo trạng thái vật lý của pha động

Phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography)

Phương pháp sắc ký lỏng (Liquid chromatography)

Liquid chromatography (LC) là một kỹ thuật phân tách trong đó pha động là chất lỏng. Được thực hiện trong một cột hoặc một mặt phẳng.  Đây là phương pháp thường sử dụng các hạt đóng gói rất nhỏ. Có áp suất tương đối cao được gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography – HPLC).

3. Sự khác biệt chính giữa Sắc ký khí và Sắc ký lỏng là gì?